Измерение спинного пресинаптического торможения у мышей, спинных потенциального записи

Пресинаптическое торможение является одним из наиболее мощных тормозных механизмов в спинном мозге. Патологические изменения пресинаптического торможения играют важную роль в механизмах развития нескольких типов заболеваний. Например, при нейропатической и воспалительной боли, а также при нарушении центральной обработки болевых сигналов.

Это имеет важное значение при травмах спинного мозга и расстройствах центральной нервной системы, сопровождающихся моторным гипервозбуждением. Таким образом, при исследовании моделей этих расстройств на животных определение силы пресинаптического торможения может дать важную информацию. В данной работе мы представляем метод оценки пресинаптического торможения на мышиной модели.

Пресинаптическое торможение in vivo опосредовано деполяризацией первичных афферентов, которая индуцируется ГАМКергическими аксо-аксональными синапсами на сенсорных пресинаптических волокнах. Активность ГАМК-A-рецепторов приводит к увеличению хлоридной проводимости, что затем вызывает деполяризацию первичного афферента из-за локального распределения ионов. Эта деполяризация блокирует распространение потенциалов действия в аксональные терминали и снижает их амплитуду, что приводит к уменьшению притока кальция и сокращению выброса трансмиттера.

Таким образом, возбуждающие постсинаптические потенциалы в моносинаптически возбуждаемых мотонейронах могут подавляться без изменения потенциала постсинаптической мембраны и возбудимости самих мотонейронов. Объемно-проводимый потенциал этой первичной деполяризации служит прямым показателем пресинаптического торможения в спинном мозге; эти потенциалы можно регистрировать с дорсальных корешков спинного мозга после стимуляции, и они называются потенциалами дорсальных корешков. Методы измерения потенциалов дорсальных корешков хорошо отработаны и широко применялись на кошках, крысах и лягушках, однако на мышах записи проводились почти исключительно на изолированных препаратах спинного мозга ex vivo. В данной работе мы описываем метод регистрации этих корневых потенциалов in vivo у анестезированных мышей, что позволяет напрямую измерить пресинаптическое торможение в интактном организме.

Для регистрации DRP in vivo у мышей требуется следующее оборудование: стандартный набор инструментов для стереотаксиса, стереомикроскоп и три микроманипулятора для позиционирования стимулирующего, регистрирующего и референсного электродов соответственно. Кроме того, необходимы стереотаксическая рама для мышей и система подогрева для контроля температуры тела животного во время стимуляции и регистрации, а также стимулятор.

Для улучшения соотношения сигнал/шум потребуются стандартный усилитель и система сбора данных. Для записи DRP необходимы изготовленные на заказ секционные электроды. Вытяните стандартные стеклянные трубки с помощью обычного пуллера для пипеток.

Сломайте кончик электрода с помощью алмазного напильника, чтобы расширить отверстие на конце. Отполируйте кончик с помощью стандартной лабораторной горелки для его сглаживания. Перед началом подготовки анестезируйте животное путем внутрибрюшинной инъекции кетамина и зафиксируйте голову мыши в стереотаксической раме.

Затем проверьте глубину анестезии, сжав заднюю лапу мыши. Приступайте к подготовке только тогда, когда отдергивание лапы отсутствует; глубину анестезии следует проверять многократно в ходе процедуры. При необходимости введите дополнительные дозы кетамина в мышцу заднего бедра.

Продлите действие анестезии, контролируя температуру тела животного с помощью ректального датчика. Для подготовки дорсального столба рассеките кожу вдоль срединной линии спины.

Отделите кожу от подлежащих тканей, чтобы изолировать позвонок от окружающей соединительной ткани. Сделайте два разреза по обе стороны позвоночника и расширьте их, раздвигая ткани скальпелем. Затем удалите остистые отростки S, используя небольшой костный ниппель.

Начните с поясничных отделов. Переходите к средним грудным отделам, чтобы предотвратить высыхание этой операционной раны. Разместите вокруг раны небольшие кусочки марли и увлажните их 0.9% sodium chloride.

Затем приступайте к подготовке спинного мозга, начиная с поясничного отдела. Осторожно введите кончик костного расширителя в пространство между двумя соседними позвонками. Особое внимание уделите тому, чтобы максимально снизить давление, оказываемое на спинной мозг.

Перейдите к грудным отделам спинного мозга, увлажняя их искусственной цереброспинальной жидкостью. Повторяйте эту процедуру на всех последующих этапах. Осторожно проколите дурометр, используя иглу калибра 30G.

Затем ослабьте фиксацию и отделите два соседних ипсилатеральных корешка от позвоночника. После этого перережьте корешки как можно более дистально. В ходе процедуры.

Избегайте чрезмерного натяжения корешков, так как это в конечном итоге помешает успешной регистрации DRP. После размещения референтного электрода рядом со спинным мозгом переместите кончик одного секционного электрода в непосредственную близость к проксимальному концу одного дорзального корешка. Затем расположите дорзальный корешок над отверстием кончика вакуумного электрода.

После этого зафиксируйте дорсальный корешок в электроде, создав кратковременное отрицательное давление с помощью шприца, подключенного к электроду. Затем заполните электрод раствором A CSF, поддерживая низкое постоянное отрицательное давление, пока раствор не окружит и дорсальный корешок, и серебряно-хлоридный провод внутри электрода. Впоследствии приподнимите кончик электрода над спинным мозгом, чтобы жидкостный мостик не вызывал короткого замыкания электрода.

Повторите эти действия для второго ипсилатерального соседнего корешка. После позиционирования обоих электродов начните регистрацию DRP, стимулируя один корешок и регистрируя сигнал с другого; увеличьте напряжение стимула до супрамаксимальных уровней. Типичные записи потенциалов дорсального корешка выглядят так, как показано на левой панели.

За кратким артефактом стимуляции следуют краткое положительное отклонение и продолжительное отрицательное отклонение. Последнее отклонение и представляет собой фактический потенциал дорсального корешка. Его амплитуду можно рассчитать относительно базовой линии, зарегистрированной непосредственно перед записью стимула.

Несколько кривых от одной пары корней, представляющих собой артефакты дыхательных движений или ЭКГ-артефакты, могут создавать помехи при регистрации DRP. После успешной регистрации можно поменять местами точки стимуляции и регистрации и провести повторную запись. Представленный метод регистрации.

Измерение потенциалов корней спинного мозга in vivo позволяет оценить первичный вход, антиполяризацию и состояние целого животного, особенно при использовании генетически модифицированных мышей. Это может быть мощным инструментом для исследования механизмов, лежащих в основе спинального торможения. Спинальная интеграция имеет решающее значение для двигательной функции и мультимодального сенсорного восприятия.

Данный метод полезен в исследованиях, посвященных боли, травмам спинного мозга, повреждениям периферических нервов и воспалению. Регистрация DRP in vivo позволяет анализировать взаимодействие супраспинальной активности и болевых ощущений. Это невозможно реализовать в изолированных препаратах спинного мозга, которые обычно используются для измерения DRP у мышей.

В принципе, введение препарата в спинной мозг возможно непосредственно во время записи. Локальное применение с помощью дополнительных пипеток может улучшить и ускорить контроль местной концентрации препарата.