Микрожидкостных Техника для исследования клеток деформируемости

Общая цель данного эксперимента заключается в исследовании способности к деформации различных типов клеток с помощью простого анализа, основанного на микрофлюидике. Это достигается путем изготовления полидиметилсубоксана или микрофлюидного устройства PDMS для зондирования временной шкалы прохождения клеток через последовательность микронных масштабов. Далее запускается программа автоматизированного анализа изображений для обработки видео и получения гистограммы данных о времени прохождения.

Результаты показывают, что разные типы клеток демонстрируют различия в способности клеток к деформации в зависимости от времени их прохождения через серию сужений. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как атомно-силовая микроскопия или аспирация микропипетками, заключается в том, что микрофлюидные устройства могут успешно работать с высокой пропускной способностью. В то время как другие микрофлюидные устройства также могут быть использованы для анализа деформуемости клеток.

Мы проектируем наше устройство таким образом, чтобы клетки проходили через последовательные сужения, геометрию, распространенную в физиологических контекстах, таких как легочное капиллярное русло. Для начала спроектируйте микрофлюидное устройство, выбрав ширину каналов сужающей матрицы примерно от 30 до 50% от среднего диаметра ячейки, а высоту канала — не менее 50% от диаметра ячейки. Включите фильтр на входных отверстиях для удаления мусора и дезагрегирования кластеров ячеек.

Прежде чем приступить к эксперименту, изготовьте мастер-устройство с использованием стандартных методов литографической микрообработки. Проверьте высоту элементов шаблона с помощью профилометра. Затем отремонтируйте источник воздуха для потока, управляемого давлением, с помощью резервуара со сжатым воздухом и последовательности регуляторов воздуха и фитингов.

Сначала настройте бак подачи воздуха и ручной регулятор. Затем установите регулятор давления с электронным управлением в одну линию с ручным регулятором. Используйте простой код, написанный в LabVIEW, для ввода желаемого давления.

Электропневматический преобразователь использует внутренний контур обратной связи для регулировки давления на выходе клапана в соответствии с заданным давлением на микрофлюидном устройстве. Установите камеру под давлением для управления потоком клеточной суспензии, собрав камеру для суспензии клеток из стандартной проточной цитометрической трубки и обработанной крышки, которая создает герметичное уплотнение на трубке. Крышка камеры давления содержит два отверстия: входное отверстие, которое соединяется с резервуаром сжатого воздуха, и выпускное, через которое ячейки поступают из камеры под давлением в устройство.

Затем установите инвертированный микроскоп с камерой со скоростью съемки не менее 100 кадров в секунду. Чтобы получить изображения клеток, протекающих через массив сужения, затем приготовьте исходный раствор поверхностно-активного вещества в фосфатно-солевом буфере или PBS, так как добавление небольшого количества поверхностно-активного вещества в раствор клеточной среды поможет свести к минимуму адгезию клеток к стенкам PDMS. Чтобы изготовить блок PDMS с микрофлюидными каналами, добавьте один грамм отвердителя к 10 граммам основы PDMS и тщательно перемешайте.

Вылейте смесь на устройство. Выдержите Дега в колокольчике с применением вакуума до тех пор, пока захваченные пузырьки не исчезнут, или в течение примерно 10-20 минут. По прошествии этого времени на интерфейсе AIR PDMS все еще могут оставаться пузыри, что является нормальным явлением.

Обычно они рассеиваются во время выпечки. Затем запекайте устройство Дега при температуре 65 градусов Цельсия в течение четырех часов после того, как устройство остынет. Извлеките микрофлюидные устройства из мастер-формы.

Начните с осторожного поднятия одного угла устройства. Медленный и бережный отслаивание в отличие от подъема Блок PD DMS прямо вверх снижает нагрузку как на PDMS, так и на ведущее устройство Вырезайте отдельные микрофлюидные устройства из блока PDMS с помощью бритвенного лезвия и снимите устройство с ведущего устройства Пробивка отверстий в устройстве PDMS для создания соединительных портов для доступа между трубками и микроканалами. Создайте отверстия от канала до внешней стороны устройства с помощью пуансона для биопсии.

Промойте устройство PDMS изопропанолом, чтобы удалить пыль и накопить кусочки PDMS. Убедитесь, что в пробитых отверстиях нет мусора, направляя постоянный поток чистого изопропанола из бутылки через отверстия. Высушить феном с помощью фильтрованного воздуха.

Очистите стеклянную подложку, промыв метанолом. Затем высушите феном отфильтрованным воздухом и поместите на горячую плиту с температурой 200 градусов Цельсия на пять-10 минут, чтобы убедиться, что стекло полностью чистое и сухое перед плазменной обработкой. Как подробно описано в текстовом протоколе, осмотрите микрофлюидное устройство под микроскопом.

Убедитесь, что каналы не схлопнуты и не сломаны, а также что входное и выходное отверстия подключаются непосредственно к каналам устройства с помощью объектива с низким энергопотреблением. Поместите клеточную суспензию в проточную цитометрическую трубку и подсоедините ее к напорному колпачку перед подключением трубки к микрофлюидному устройству, отрегулируйте давление примерно до 14–21 килопаскаль и промывайте до тех пор, пока клеточная суспензия не выйдет из кончика трубки. Затем поместите устройство на ровную поверхность, чтобы вставить трубку во входное отверстие устройства.

Так как стеклянная крышка, приклеенная к нижней стороне устройства PDMS, является хрупкой. Вставьте наконечник трубки, содержащей суспензию ячеек, во входное отверстие устройства. Затем вставьте кусок трубки в выходное отверстие и проложите его в пустую трубку для сбора отходов, например, в пустую трубку Falcon, прикрепленную скотчем к боковой стороне предметного столика микроскопа.

Осторожно увеличьте давление примерно до 28 килопаскаль или до тех пор, пока клетки не пройдут через каналы. Расположите устройство так, чтобы несколько каналов находились в поле зрения и были перпендикулярны нижней части экрана. Чтобы начать анализ данных, откройте файл master script m и запустите программу.

Выберите первое видео для анализа в появившемся окне проводника Windows. Укажите частоту кадров для выбранного видео и нажмите Enter. Появится рисунок, который предложит пользователю выбрать прямоугольное окно обрезки.

Для первого видео выберите окно, охватывающее все каналы слева направо и пересекающее каналы непосредственно над первой лампочкой массива каналов. Вверху и внизу выберите области сужения из обрезанного изображения. Алгоритм отображает сегментацию ячеек для первых 50 кадров каждого видео.

Внимательно следите за изображением в верхнем левом углу, чтобы определить, точно ли алгоритм определяет местоположение ячеек. На исходное видео накладывается искаженное изображение. Чтобы продемонстрировать расположение идентифицированных ячеек, выберите следующее видео для обработки в окне проводника Windows.

Алгоритм повторится. Для каждого выбранного видео выберите «Отмена». После того, как все нужные видео были добавлены через окно Проводника Windows для указания функции о том, что список видео является полным, репрезентативные результаты для времени прохождения клеток HL 60 и типа нейтрофилов HL 60 показывают временную шкалу для прохождения одной клетки через серию суженных транзитов.

Время измеряется для популяции отдельных клеток при каждом сужении в семь микрометров в серии из семи сужений. При давлении 28 кПа элементы HL 60 временно окклюзируют первое сужение в среднем на 9,3 миллисекунды перед упаковкой через последующие сужения. Напротив, клетки нейтрофильного типа HL 60 окклюзируют первую констрикцию всего за 4,3 миллисекунды до упаковки.

Пройдя через первую констрикцию, клетки проходят быстрее через оставшиеся сужения от двух до семи, со средним временем прохождения 4,0 миллисекунды для клеток HL 60 и 3,3 миллисекунды для клеток нейтрофильного типа. Сравнивая время прохождения между клеточными популяциями, можно выявить различия в деинформативности клеток. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как измерить способность к деформации различных типов клеток с помощью простого микрофлюидного анализа.

В этом случае поток, управляемый давлением, используется для прогона клеток через микрофлюидные каналы, что позволяет анализировать деформацию и расслабление отдельных клеток.