Перерезки спинного шнур в личиночной данио рерио

Общая цель данной процедуры — обеспечить полное пересечение спинного мозга у личинок zebrafish с помощью относительно высокопроизводительного и воспроизводимого метода при максимальном уровне выживаемости. Для этого сначала проводят скрещивание взрослых особей соответствующего генотипа с последующим скринингом при необходимости. На втором этапе эмбрионы выращивают до пятого дня после оплодотворения.

Затем выполните пересечение с помощью микроинъекционной пипетки со скошенным срезом. В завершение поврежденным рыбам дают восстановиться в среде с антибиотиками до конца эксперимента. В итоге для демонстрации ответа нейральных предшественников на повреждение используется иммунофлуоресцентная микроскопия.

Основные преимущества этого метода по сравнению с существующими подходами, такими как методы, разработанными в лабораториях Беккера и Фетчера, включают возможность изучения большего количества животных, сокращение времени восстановления и использование генетических инструментов, которые иначе недоступны у взрослых особей zebrafish. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенерации, такие как реакция нейральных прогениторов на повреждение. Начните подготовку с изготовления операционных пластин, используя чашки Петри диаметром 60 миллиметров и набор силиконового эластомера Cell-Guard 180 4.

Следуя инструкциям производителя, заполните чашки не более чем наполовину и дайте им полимеризоваться. Затем храните закрытые чашки при комнатной температуре.

Затем изготовьте микропипетки, нагревая и вытягивая боросиликатные капиллярные трубки с тонкими стенками в микропипеточном пуллере, используя те же настройки, что и при изготовлении игл для микроинъекций под диссекционным микроскопом. С помощью пинцета отломите кончик микропипетки так, чтобы его диаметр составлял примерно 200 microns. Затем зашлифуйте сломанный край микрошлифовальным устройством, сначала под углом 35 градусов, а затем повторно под углом 25 градусов, когда прекратится шум шлифовки.

Проверьте под диссекционным микроскопом, чтобы кончик был острым и гладким. Использование слишком широкого кончика обычно приводит к более высокой смертности из-за повышенной вероятности повреждения дорсальной аорты. В то время как слишком узкий кончик может соскальзывать с кожи, не рассекая ткани, правильно скошенные микропипетки следует хранить в чашке Петри на небольшом количестве глины за семь дней до операции.

Подготовьте резервуары для спаривания самцов и самок spr. Соберите оплодотворенные эмбрионы на следующее утро, через три часа после включения света, чтобы обеспечить максимальный выход.

При использовании трансгенной репортерной линии со смешанными генотипами поместите по 100 эмбрионов на каждую планшетку и инкубируйте их при температуре 28,5 °C. При использовании репортерной линии проведите скрининг эмбрионов на наличие флуоресцентной экспрессии через 48 часов после оплодотворения.

Дайте флуоресцентным эмбрионам созреть при 28.5 °C до стадии личинки или пятого дня после оплодотворения. Подготовьте операционную пластину, покрыв защитную сетку для клеток раствором E2 с добавлением 10 mg/L сульфата гентамицина и Trica. Кроме того, подготовьте чашку для восстановления, добавив 25 mL E2 и сульфата гентамицина в чашку Петри диаметром 100 mm.

Следующим шагом является подготовка рукоятки скальпеля путем склеивания трех тампонов с помощью клейкой ленты. Таким образом формируется треугольный инструмент с тремя желобками. Затем закрепите подготовленный микропипет на тампонах, зафиксировав его лентой в одном из желобков для завершения сборки скальпеля; отложите микропипет до момента использования.

Начните операцию с анестезирования личинок, обрабатывая по одной планшете на 25 особей за раз. При использовании trica рыбы считаются достаточно анестезированными, когда у них пропадает реакция на прикосновение. Перенесите личинок в операционный планшет и поместите его под диссекционный микроскоп.

При максимальном увеличении поверните одну личинку так, чтобы она лежала на боку, а спинка была обращена к руке, удерживающей скальпель. Расположите пинцет так, чтобы он опирался на ограничитель ячейки. Установите стеклянный скальпель под углом к ширине личинки, используя одну из branches пинцета в качестве опоры.

Сделайте разрез на дорсолатеральной стороне личинок на уровне анального отверстия. Убедитесь, что разрез не заходит за вентральный край спинного мозга. Затем поверните скальпель, чтобы перерезать спинной мозг.

Требуемый поворот обычно составляет гораздо меньше 90 градусов. Повторите перерезку спинного мозга для остальных личинок. После завершения операции на данной группе личинок используйте заднюю пипетку и пипеточный насос, чтобы перенести поврежденных животных на планшет для восстановления.

Чтобы вывести личинок из состояния анестезии, при переносе сначала захватывайте личинку за голову или за хвост. Не подвергайте место повреждения стрессу, не сгибая личинок после того, как действие анестезии прекратится. Перенесите поврежденных личинок из планшета для восстановления в 100-миллиметровые чашки, заполненные 25 мл E2 и сульфата гентамицина, с плотностью 25 личинок на чашку.

Затем поместите их в инкубатор при температуре 28,5 °C до заживления раны. Ежедневно проверяйте планшеты, удаляя всех больных или погибших животных.

Не меняйте среду до тех пор, пока в ней не станут видны коконы пресноводных простейших. При замене среды не переносите рыб в новый планшет. Вместо этого удалите максимально возможный объем среды и заполните тот же планшет новой средой.

При необходимости повторите смену среды, чтобы сократить популяцию микроорганизмов. Ежедневно кормите личинок небольшим количеством порошкового корма для мальков. На данном изображении представлена рыбка-зебра через один день после полного пересечения спинного мозга.

После повреждения GFP экспрессируется во всех нейронах, а желтая стрелка указывает на место повреждения. Здесь показана зебранизая рыбка с полностью пересеченным спинным мозгом на третий день после повреждения. На этой зафиксированной рыбке с маркировкой UCD виден полностью пересеченный спинной мозг.

Желтая стрелка снова указывает на место повреждения. Напротив, непрерывная область маркировки нейронов вдоль вентрального края спинного мозга у этой зафиксированной зебранины через три дня после повреждения свидетельствует о неполном пересечении.

После освоения методики с ее помощью можно обрабатывать до 300 личинок в час.