Охвате Анализ: Протокол для оценки взаимодействия между ЦНС фагоцитов и нейронов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы визуализировать и количественно оценить поглощение пресинаптических входов микроглией. Это достигается путем предварительного введения флуоресцентных индикаторов переднего класса в глаза, чтобы пометить пресинаптические входы ганглиозных клеток сетчатки в латеральном генантном ядре. Второй шаг — препарировать, зафиксировать и уравновесить мозг.

Далее мозг рассекается. Последним шагом является крепление участков мозга на покровной кромке для визуализации и анализа. В конечном счете, конфокальная микроскопия используется для оценки поглощения пресинаптических входов микроглией.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, как фагоцитарные почвы способствуют пластичности и ремоделированию синаптических контуров. Хотя этот метод может дать представление о ремоделировании синаптических цепей в здоровом мозге, он также может быть применен к другим системам, таким как ремоделирование синаптических цепей во время заболевания нервной системы. Демонстрировать процедуру будут Крис Хеллер, техник, и Эмили Ламан, аспирантка из лаборатории Стивенса.

Начните эту процедуру с обезболивания мыши 4%-ным фтором ISO в индукционной камере из плексигласа. Через одну-три минуты убедитесь, что достигнут соответствующий уровень анестезии, защипнув хвост. Затем положите мышь на бок под стереомикроскоп и поместите носовой обтекатель, который подает от 3 до 4% фтора ISO на морду.

Чтобы обнажить склеру, используйте маленькие пружинные ножницы, чтобы открыть веко и оттянуть кожу. Для новорожденных иногда необходим еще один перпендикулярный разрез в уголке глаза. Будьте осторожны при разрезании уголка века, так как там находится кровеносный сосуд.

С помощью стерильной иглы 30,5 калибра проколите небольшое отверстие сбоку глаза, где начинается склера. Будьте осторожны, чтобы не повредить линзу, вставив иглу ровно настолько, чтобы скос вошел в глаз. Дайте стекловидному телу вытекать из отверстия и используйте стерильный аппликатор с разрезом и наконечником, чтобы впитать жидкость.

Как только стекловидное тело перестанет вытекать из отверстия, медленно введите иглу с тупым концом, прикрепленную к шприцу Гамильтона, который был предварительно загружен с отслеживанием передней степени. Красите в отверстие, медленно вводите краситель в глаз. Как правило, бета-субъединица холерного токсина, конъюгированная с Alexa 5 94, 6 47 или 4 88, используется для переднего сорта.

Поздние входы трассировки R GC Оставьте иглу в отверстии на несколько секунд, а затем медленно извлеките ее. Используйте аппликатор с ватным наконечником, чтобы впитать лишнюю жидкость и предотвратить вытекание красителя. Затем нанесите на глаз небольшое количество мази с антибиотиком.

Если глаз был открыт хирургическим путем. Аккуратно переместите веки вместе после инъекции. Оставьте мышь под тепловой лампой или на грелке до тех пор, пока она не начнет восстанавливаться после анестезии.

Верните мышь в чистую домашнюю клетку и следите за ней, чтобы убедиться, что она полностью проснулась, прежде чем возвращать ее в колонию. Примерно через 24 часа после инъекции принесите мышь в жертву и препарируйте мозг. Зафиксируйте мозг в трубке Falcon, наполненной 4% PFA, на ночь при температуре четыре градуса Цельсия на следующий день.

Промойте мозг три раза в PBS, сначала налив мозг и PFA в пустую сывороточную лодку, затем с помощью шпателя перенесите мозг в другую сывороточную лодку, наполненную PBS. Промойте мозг еще два раза в PBS, прежде чем перенести его в трубку Falcon, заполненную 30% раствором сахарозы. Оставьте его в сахарозе при температуре четыре градуса Цельсия, пока он не опустится на дно пробирки.

После этого удалите все части мозга, которые не нужны, с помощью лезвия бритвы. Заморозьте мозг на куске алюминиевой фольги над сухим льдом. Тем временем заморозьте стадию микротома и заполните каждую лунку 24-луночной пластины половиной миллилитра 0,1 моляра PP, чтобы установить замороженный мозг на стадию замораживания.

Нанесите небольшое количество ОКТ на предметную область. Как только ОКТ начнет замерзать, заложите в него мозг. Сторона мозга, которая будет разрезана, должна быть обращена вверх.

Далее накройте мозг и ОКТ очень мелко измельченным сухим льдом. Оставьте сухой лед на мозге примерно на 30 секунд. Затем с помощью большой кисти удалите сухой лед.

Начните нарезать ломтики толщиной 40 микрон. Затем с помощью небольшой влажной кисти удалите участки, содержащие интересующую область, с лезвия и перенесите их на 24-луночную пластину, содержащую 0,1 молярного pb. После того, как срезы будут собраны, визуализируйте маркировку передней степени под флуоресцентным препарирующим микроскопом и выберите срезы, содержащие интересующую область, для крепления срезов на предметное стекло.

Сначала приложите небольшую пулю 0,1 молярного PB к заряженному микроскопу. Далее горка, перенесите срезы ткани в бассейн pb. Затем с помощью кисти сориентируйте и распределите салфетки.

Используйте салфетку Kim для отвода XSPB и следите за тем, чтобы секция не отводилась. Дайте им полностью высохнуть на воздухе. Затем нанесите небольшую каплю монтажного средства на каждую секцию и закрепите крышку сверху в конце.

Заклейте края горки лаком для ногтей. Храните предметное стекло при температуре минус 20 градусов Цельсия до показанного сеанса визуализации. Ниже приведена схема стратегии трассировки передней стадии.

Входы RGC левого и правого глаза трассируются с помощью CTB 6 47 и CTB 5 94 соответственно. Впоследствии оценивается опосредованное микроглией поглощение входных данных. Вот репрезентативное изображение с малым увеличением после внутриутробного пятого дня DLGN мыши после межсезонной трассировки входных данных левого и правого глаза.

Это микроглия, взятая из пограничной области входных сигналов левого и правого глаза. Вся флуоресценция CTB за пределами микроглиального объема была вычтена, что выявило входы RGC, которые были поглощены, и поверхностную визуализацию микроглии и поглощения. Входные данные RGC показаны здесь.

Вот репрезентативная поверхность, визуализированная микроглией мыши P five, P nine и P 30. DLGN Поглощение входных ресурсов RGC значительно увеличивается во время пиковой обрезки в DLGN по сравнению с более старшим возрастом. Микроглия мышей с дефицитом третьего рецептора комплемента поглощает значительно меньше входов RGC по сравнению с однопометниками дикого типа.

Эту методику можно выполнить за 72 часа, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как интергрейдировать помеченные нейроны и оценить взаимодействие синапсов микроглии.