В естественных условиях Optogenetic возбуждение нервной системы грызунов Центральной

Общая цель этой процедуры заключается в успешном проведении in vivo оптогенетической стимуляции центральной нервной системы грызуна у бодрствующего, свободно передвигающегося животного. Это достигается путем предварительной настройки и конфигурирования соответствующей лазерной системы для проведения оптогенетической стимуляции. Затем волоконная оптика, совместимая с поведенческим тестированием, настроена на подачу лазерного света к имплантированному оптоволоконному кабелю и в интересующую область мозга, выражающую опсин.

Затем животное привязывают к лазерной системе для оптогенетической стимуляции и помещают в аппарат для поведенческих тестов. Наконец, определенные экспериментатором параметры световой стимуляции для включения или выключения нейронов подаются в то время, когда животное выполняет поведенческую задачу. В конечном счете, in vivo оптогенетическая стимуляция используется для того, чтобы обеспечить контроль в режиме реального времени над определенными популяциями нейронов или нейронных цепей у бодрствующих животных, чтобы определить их функциональную роль в данном поведении, представляющем интерес.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами заключается в том, что он позволяет в режиме реального времени контролировать генетически и пространственно определенные популяции нейронов у бодрствующих животных с временным разрешением, необходимым для связывания паттернов нейронной активности со сложными поведенческими состояниями. Этот протокол включает в себя использование лазеров класса B третьего класса B и требует соблюдения надлежащей подготовки и рекомендаций по технике безопасности. Защитные очки необходимо постоянно носить при работе с лазерами с процедурами юстировки, представляющими особенно высокий риск, после настройки лазерного аппарата в соответствии с текстовым протоколом выполнять бесконтактное лазерное сопряжение внутреннего синего лазера, предварительно установив переключатели на тыльной стороне лазера для режима тока и TTL для транзисторного транзисторного логического режима для постоянного освещения на передней части драйвера, Убедитесь, что ручка питания установлена на ноль.

Затем включите лазер, включив сначала драйвер, а затем лазерный ключ. Чтобы обеспечить безопасность для глаз, медленно отрегулируйте ручку питания так, чтобы излучалась примерно одна милливатт лазерного света. Затем подождите от 10 до 15 минут, чтобы лазер нагрелся.

Затем подключите тестер оптоволоконного кабеля непосредственно к свободному концу патч-корда муфты и включите тестер кабеля. Затем отрегулируйте угол наклона муфты так, чтобы красный луч шел прямо назад к центру дихроичного зеркала. Траектория луча красного света, излучаемого тестером кабеля, является точной траекторией, по которой должен пройти входящий лазерный свет, чтобы быть соединенным с лазером.

Чтобы выполнить выравнивание курса, используйте боковые и горизонтальные ручки на кинематических зеркалах, чтобы направить луч лазерного света в соединитель. Не беспокойтесь, если в это время синий свет не излучается из патч-корда, прикрепленного к муфте. Теперь поместите один лист полупрозрачной бумаги прямо перед дихроичным зеркалом между дихроичным зеркалом и муфтой.

На одной и той же стороне этой бумаги будет синяя и красная точка от лазера и тестера кабеля соответственно. Произведите точную регулировку первого рулевого зеркала, тщательно отрегулировав боковые и горизонтальные ручки, чтобы выровнять центр красной точки с синей точкой. Переместите бумагу обратно к муфте так, чтобы она оказалась прямо перед ним, и отрегулируйте ручки на втором дихроичном зеркале, чтобы выровнять лазерный луч с красным лучом.

Продолжайте выполнять тонкую коррекцию двух зеркал до тех пор, пока центры синего и красного лучей не будут точно совмещены. Колин, снимите кабельный тестер со шнура муфты. Теперь лазерный свет должен подаваться с конца патч-корда муфты.

Чтобы определить эффективность связи, используйте измеритель световой мощности, чтобы сравнить мощность света, поступающего в соединитель, с мощностью света, излучаемой с конца оптоволокна. Эффективность соединения более 80% считается очень хорошей при сохранении положения дихроичного зеркала. Используйте два рулевых зеркала для внешнего желтого лазера и следуйте только что продемонстрированной процедуре юстировки для сопряжения желтого лазера, чтобы настроить оптическое волокно для стимуляции одной мыши.

Начните с использования адаптера кронштейна F-C-F-C-L, прикрепленного непосредственно к макетной плате, чтобы подключить патч-корд муфты к патч-корду с толстой оболочкой. Прикрепите вращающееся соединение коллектора к свободным концам патч-корда с толстой оболочкой. Затем прикрепите патч-корд животного к коммутатору.

Прикрепите соединительную разрезную втулку к свободному металлическому дикому концу патч-корда животного, не заставляя рукав полностью подниматься. У диких животных остается открытым около 0,5 сантиметра рукава, так как именно он соединяется с оптоволоконным кабелем, прикрепленным к животному кабелем BNC. Подключите драйвер синего лазера к генератору импульсов и включите генератор импульсов.

Теперь наденьте соответствующие защитные очки. Затем, убедившись, что ручка питания на передней части драйвера установлена на ноль, включите лазер, сначала включив драйвер, а затем лазерный ключ с лазером установлен в положительный режим TT L. Медленно отрегулируйте ручку на передней панели лазера и с помощью измерителя мощности света установите световое излучение мощностью от 5 до 10 милливатт от кончика патч-корда животного.

Обратитесь к текстовому протоколу для получения дополнительной информации об этой настройке. Переключите синий лазер в аналоговый режим для стимуляции in vivo и подождите от 10 до 15 минут, пока лазер нагреется. Затем аккуратно задержите мышь и соедините разрезную втулку на патч-корде животного с хроническим имплантируемым волокном.

Убедитесь, что концы обоих волокон Установите физический контакт друг с другом, используя разрез на соединительной втулке в качестве окна для визуализации прямого контакта между ними. Дайте мыши восстановиться в течение нескольких минут до начала поведенческого тестирования. Затем поместите животное в аппарат для поведенческих испытаний, убедившись, что соединительный шнур свободен от зацепок.

Используйте генератор импульсов, чтобы запустить синий лазер с заданной частотой, который активирует выбранный вариант. После завершения эксперимента гистологическое подтверждение размещения вируса и клетчатки в соответствии с сопроводительным текстовым протоколом для точной интерпретации поведенческих результатов. Под микроскопом проверьте место экспрессии опсина и волоконный имплантат и визуально подтвердите правильное размещение инъекции вируса и имплантата на основе выбранных координат.

В этом примере поведенческих результатов, полученных с помощью оптогенетической стимуляции in vivo, дофаминовые нейроны в вентральной области или VTA тирозингидроксилазы кремового крема мышам трансдуцировали либо со стабильной ступенчатой функцией OPSIN, либо EYFP в качестве контролируемого вируса и хронически имплантировали фибровый имплантат. Группы мышей одновременно стимулировались, и поведение локомотива регистрировалось в течение одного часа, как показано здесь. Повторная стимуляция операционного и трансдуцированного мышей слева приводила к гиперактивному фенотипу, который сохранялся на протяжении всей стимуляции.

В то время как у контрольной мыши справа после поведенческого тестирования не было замечено никаких изменений в поведении локомотива, была проведена иммуногистохимическая терапия для проверки точного нацеливания вируса на дофаминовые нейроны VTA, и размещение волокон было визуально подтверждено, как показано на этом рисунке после освоения. Этот метод может быть использован для манипулирования нейронной активностью в любой интересующей области мозга в сочетании с различными поведенческими тестами в качестве функционального считывания модуляции нейронной цепи.