Полное Травма спинного мозга и мозга Вскрытие протокол для последующего Wholemount На месте Гибридизация в личинок морская минога

Общая цель этой процедуры заключается в проведении полного обследования спинного мозга, пересечения и вскрытия головного мозга для изучения направления Axon после травмы. Это достигается путем первого пересечения лампы спинного мозга на уровне пятой жабры. Затем мозг препарируется и прикрепляется к силгарду.

После фиксации в мозге он может быть сохранен в метаноле или сразу же использован для гибридизации in situ, в конечном итоге изменяется экспрессия аксоналей. Направляющие рецепторы можно увидеть в регенерирующих позвонках после травмы спинного мозга. Преимущество метода, который мы продемонстрируем сегодня, по сравнению с более традиционными парафиновыми или криостатными срезами, заключается в том, что он позволяет увидеть весь мозг, включая нейроны, которые проецируются в спинной мозг, которые являются большими и идентифицированными.

Эту процедуру демонстрирует доктор Кэти Занг, научный сотрудник нашей лаборатории «Из ручьев, питающих притоки озера Мичиган, в реку Делавэр в Пенсильвании или ручьев в штате Мэн». Дикий тип личинки морской миноги данного вида. Были получены домашние мыши на Марусе.

Личинки в возрасте от 4 до 7 лет имеют длину от 10 до 14 сантиметров и достаточно велики для получения травмы и вскрытия. Поддерживайте их группами по 52, по сто человек. В 50 галлонах баки с пресной водой при температуре 16 градусов по Цельсию.

Для аквариума требуется гравийный субстрат толщиной в один дюйм, чтобы минога могла заимствовать всю воду, добавляемую в аквариум, следует отваривать с помощью фильтрации древесным углем и аэрации в течение не менее 48 часов, прежде чем она будет добавлена в аквариум. При условии использования животных в течение одного года, нет необходимости кормить их для этой процедуры. Имейте наготове свежеприготовленный раствор для рингера.

Сначала переведите лампу в насыщенный водный раствор бензокаина. После обезболивания переложите его в блюдо, наполовину наполненное силом гардом. Поставьте блюдо на лед и посыпьте его льдом.

Холодные звонки. Закрепите животное тремя булавками от насекомых диаметром 0,15, одной на морде и двумя на пятой жаберной. Затем поместите его под стереомикроскоп для операции.

Начните с того, что с помощью скальпеля под номером 11 сделайте продольный разрез вдоль дорсальной средней линии на уровне пятой жабры. При этом будет виден спинной мозг во время выполнения этого разреза. Используйте два крючка, сделанных из булавок от насекомых, чтобы закрепить стенки тела с помощью ножниц Кастро номер восемь.

Сделайте перпендикулярный разрез поперек обнаженного спинного мозга. Осмотрите отрезанные концы спинного мозга, чтобы убедиться, что пересечение завершено. Затем с помощью щипцов выровняйте срезанные концы и закройте рану.

Перенесите лампу лавы на лист фильтровальной бумаги, смоченный в растворе рингера. Переместите препарат на слой льда на час, чтобы рана могла подсохнуть через час. Переведите лаву в собственный небольшой резервуар с ледяной водой.

Дайте ему зажить там в течение 24 часов. Через 24 часа проверьте наличие подвижности кордового по отношению к пересечению. Если есть какие-либо движения, то пересечение было неполным.

Если их нет, значит, разрез был хорошим, и животное можно переместить в резервуар комнатной температуры для восстановления, пока животное восстанавливается. Меняйте воду каждые два-три дня. Как только пересеченное животное достаточно восстановится, сделайте ему анестезию и подготовьте к вскрытию, как описано ранее.

Чтобы вскрыть мозг, начните с поперечного разреза между ноздрей и шишковидным органом. Затем с помощью телятины Кастро ножницы разрезают ткани, окружающие мозг, фиксируя животное. С помощью щипцов.

Белые овальные структуры по обе стороны от ствола мозга являются отличными капсулами. После того, как мозг обнажен, используйте щипцы для удаления сосудистого сплетения. Далее с помощью модифицированных булавочных крючков раздвиньте голову животного и обнажите черепно-мозговые нервы.

Затем разрежьте ножницами спинной мозг поперек, фиксируя спинной мозг щипцами. Разрежьте черепно-мозговые нервы, чтобы рассечь мозг. Затем перенесите мозг на небольшой кусочек силикона и закрепите его там.

С помощью одного штифта от насекомых в спинном мозге и одного штифта через одну из обонятельных луковиц. Затем с помощью ножниц разрежьте межобонятельную комиссуру межобонятельной луковицы, комиссуру мозгового протектора и отход ствола мозга по дорсальной средней линии. После того, как спайки и спайки будут срезаны, отклоните пластины A LR в сторону и прикрепите их к силикону в общей сложности семью штифтами от насекомых, два в обонятельных луковицах, два по краям разреза, комиссурой церебрального протектора, два в расширенной OEX и одним в средней линии спинного мозга.

Теперь, используя свободные реагенты от РНК, зафиксируйте препарат в 4%-ном параформальдегиде при комнатной температуре в течение трех часов с легким перемешиванием. Затем мозг может быть проанализирован с помощью гибридизации in situ two с использованием описанного метода, экспрессия неогена в транскриптах была идентифицирована в спинном мозге, проецируя нейроны контроля, животных и у животных. Через две недели после поражения здесь виден репрезентативный неповрежденный контроль.

После полного пересечения спинного мозга наблюдались изменения в экспрессии неогенного рецептора. Через две недели неогенный рецептор в неконтрольной группе преимущественно экспрессировался в плохих регенераторах, таких как M1 I one I two I 4 или MTH нейроны. Развитие этой техники проложило путь к нашей способности исследовать экспрессию направляющих рецепторов, рецепторов хондроитина сульфата, протио, гликанов и активации литых оснований в одном и том же мозге.