Липидов Bilayer везикул поколения Использование микрофлюидных струйное

Общей целью этой процедуры является получение фосфолипидных бислойных везикул с усиленным контролем над мембраной, унла, молярностью, монодисперсностью и внутренним содержимым. С помощью CAD камера изготавливается из акриловых листов и натурального каучука. Взвешенный липидный бислой получают путем загрузки камеры липидами и раствором.

Затем струйная камера, содержащая раствор, подлежащий инкапсуляции, устанавливается с помощью струйного аппарата. После того, как будут установлены соответствующие настройки, струйные импульсы жидкости будут производить липидные двухслойные везикулы. В конечном счете, микрофлюидная струйная обработка позволяет получить воспроизводимые монодисперсные двухслойные везикулы.

Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими методами, такими как электрообразование, эмульсия или генерация капель, является повышенный уровень контроля, регулирующий мембрану, одностороннюю молярность, монодисперсность и внутреннее содержимое. Демонстрировать процедуру будет Джоанна Харроу, аспирантка лаборатории, а ассистировать будет Кара Патель, студентка бакалавриата. Используя программное обеспечение CAD, нарисуйте форму камеры, которую можно сделать из акрила с помощью первого сверла лазерного резака, по одному 16-дюймовому сквозному отверстию с обеих сторон собранной акриловой камеры. Что будет стекать до бесконечности в форме колодца.

Во-вторых, вырежьте ножницами небольшой прямоугольник из акрилового листа толщиной 0,2 миллиметра, который будет служить нижней частью формы бесконечности. Хорошо закрепите его на месте с помощью быстросохнущего клея, следя за тем, чтобы клей не попал в места просмотра. Акриловый лист должен быть заподлицо к стенке камеры и закреплен на дне камеры.

В-третьих, с помощью быстросохнущего клея приклейте тонкий кусок листа натурального каучука поверх просверленных отверстий. Прижмите их на место пинцетом. Проверьте все проклеенные швы на герметичность.

Их быть не должно. Наконец, с помощью иглы 23 калибра проделайте отверстия в резине через просверленные отверстия, через эти отверстия будет вставлен пьезоэлектрический струйный наконечник. Исходные фосфолипиды следует растворить в хлороформе и хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия.

D-P-H-P-C или DOPC. В этой демонстрации используются липиды. Растворенные в хлороформе липиды переносят в стеклянный флакон, держа флакон под углом, аккуратно просушивают липиды под аргоном или газообразным азотом.

Затем поместите флакон со слегка ослабленной крышкой под вакуум на один-два часа, чтобы удалить остатки растворителя. Для этого шага также можно использовать влагопоглотитель. Теперь растворите липиды в торцевом настиле до конечной концентрации липидов 25 мг на миллилитр.

Вихревой раствор. Ненадолго закройте колпачок парамом, а затем просните ультразвуком в течение 15 минут. Хранят такой раствор при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

Далее приготовьте бульонный раствор сахарозы с физиологической подобной осмолярностью. Это решение для струйной очистки. Подумайте о том, чтобы добавить каплю темного пищевого красителя или флуоресцентных шариков в раствор для добавления контраста или флуоресценции.

Загрузите раствор сахарозы в одномиллилитровый шприц, чтобы удалить захваченный воздух. Взбейте шприц так, чтобы любые пузырьки поднялись к отверстию приманки и могли быть выброшены. Далее присоедините к шприцу 33-миллиметровый фильтр 0,22 микрона и протолкните через фильтр одну каплю.

Теперь открутите гнездовой адаптер приманки струйного принтера и надавите им на торец фильтра. Вытолкните немного жидкости, чтобы удалить попавший воздух. Наконец, прикрепите шприц к верхней части жидкости для струйной печати.

Должен переместиться к наконечнику струйного принтера, если шприц был правильно прикреплен. Сначала установите шприц в сборе на предметный столик микроскопа и подключите контроллер струйной печати для этого эксперимента. Предметный столик и шприц нуждаются в независимом управлении, при этом предметный столик и шприц перемещаются в трех измерениях для визуализации.

Настройте высокоскоростную камеру, способную делать не менее 1000 кадров в секунду. Настройте его на использование автоматического запуска на основе изображений для запуска записи. Теперь закрепите камеру на сцене с помощью скотча и аккуратно совместите наконечник струйного принтера с отверстием, сделанным в резиновом листе сбоку камеры.

Сначала отрегулируйте на глаз, а затем выполните тонкую регулировку с помощью микроскопа. После выравнивания выверните шприц назад на одно измерение, чтобы загрузить форму бесконечности. Ну а затем слегка надавите на поршень, чтобы на сопле образовалась капля.

Это обеспечивает некоторое первоначальное противодавление. Необходимо задать параметры струйной обработки. Далее на экране представлены конкретные значения трапециевидной биполярной волны и количество струйных импульсов на один размер везикулы управления триггером.

Теперь загрузите в камеру от 25 до 30 микролитров липидного раствора в конце десятилетия, покрывая всю поверхность бесконечности. Ну а потом к каждому, хорошо добавляем по 25 микролитров раствора глюкозы к крайнему краю пипетирования медленно и плавно, глюкоза не должна смешиваться с липидным раствором. В течение 10 минут в центре камеры образуется липидный бислой.

Настройка бислоя является наиболее важным этапом, поскольку бислой нестабилен и может сломаться в зависимости от подготовки. Потерпеть. Это сработает, как только вы потренируетесь заполнять камеру несколько раз.

Теперь осторожно вставьте наконечник струйного принтера обратно в камеру, когда наконечник находится в пределах 200 микрон от границы раздела капель. Бислой, запустите процесс струйной обработки и запишите данные с помощью струйной печати, предоставив представление о процессе образования везикул. Например, изменение расстояния между струйным соплом и липидным бислоем влияло на силу, которая деформирует мембрану. Закрывать.

Близость к бислою фокусировала струйное течение и не позволяла мембране рассеивать энергию от точки образования везикул. Кроме того, ход вихря увеличивался с напряжением, подаваемым на электрический привод пизо. Образование везикул визуализировалось как последовательность событий, следующих за их образованием.

Стабильность везикул, как правило, изменяется в зависимости от диаметра везикулы, при этом меньшие везикулы более стабильны. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как генерировать везикулы нарушителя липидов с помощью микрофлюидной струи.