Два Методы Создание первичных клеток человека эндометрия стромальных от гистерэктомии образцов

Общей целью этой процедуры является создание первичных культур стромальных клеток эндометрия из резецированных гистерэктомий. Это достигается путем выделения и разделения слоев матки для выделения участка ткани эндометрия. Вторым шагом является выбор метода выделения клеток между методами скреба и триина при использовании метода выскабливания.

Механическая сила и выскабливание используются для разделения и диссоциации стромальных клеток эндометрия. В качестве альтернативы, при использовании метода трипсина, ферментативная активность трипсина используется для разделения и диссоциации стромальных клеток эндометрия. В конечном счете, микроскопия используется для наблюдения за ростом и морфологией клеток, в то время как другие методы, обсуждаемые в рукописи, используются для верификации стромальных культур эндометрия.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы физиологии в репродуктивной области, такие явления, как репродуктивный цикл и менструация Образцы гистерэктомии, использованные в этой рукописи, были собраны в соответствии с утвержденным университетским IRB этическим протоколом под номером I-R-B-H-S-R номер 1 4 4 2 4. Сохраняйте ткани, полученные от пациента, в 50-миллилитровой пробирке, содержащей RPMI или DMEM с высоким содержанием глюкозы при четырех градусах Цельсия, не более чем за 24 часа до обработки образца. Когда все будет готово, промойте образец ткани три раза одним XPBS и выбросьте раствор между каждым промыванием.

Затем добавьте от четырех до 10 миллилитров питательной среды с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина стрептомицина в образец ткани. Также добавьте грибную зону до конечной концентрации 0,25 микрограмм на миллилитр и выдержите в течение 30 минут. Далее выбросьте питательную среду и дважды промойте ткань одним XPBS.

Поместите ткань на шестисантиметровую клеточную культуральную пластину и определите слой эндометрия, используя эти изображения в качестве ориентира. Затем отделите эндометрий и сохраните остальные слои ткани для дальнейшего использования. Используйте скальпель или бритвенное лезвие, чтобы разрезать ткань на мелкие кусочки, царапая при этом чашку для клеточной культуры.

Царапины облегчают прикрепление формирующихся первичных стромальных клеток эндометрия. Далее аккуратно добавьте в поцарапанную посуду два миллилитра питательной среды. На этом этапе фрагменты ткани будут видны и обездвижены от царапающего движения.

Поместите чашку в специальный инкубатор для клеточных культур отдельно от других клеточных линий, чтобы избежать заражения. Ежедневно контролируйте клетки с помощью светового микроскопа. Ищите небольшие популяции клеток, которые появляются из разрезанной ткани на второй или третий день каждые три дня.

Аккуратно удалите старые среды из промойте культуры одним XPBS, а затем добавьте два миллилитра свежей питательной среды. Начните добавлять четыре миллилитра питательной среды. Как только скорость пролиферации увеличится, на этапах мытья удалите оставшиеся кусочки ткани.

Новые колонии вряд ли появятся из ткани. После одной недели прохождения роста, клетки используют 0,05% трипсина. Когда клетки достигают от 75 до 80% плавности, тогда замораживают одну пластину клеток.

После того, как две или три пластины будут сохранены, первичные клетки не могут проходить бесконечно. Чтобы начать опосредованное выделение трипсина, поместите небольшой кусочек эндометриальной ткани в коническую трубку с двумя миллилитрами 0,25% трипсина, дополненного 0,03 мг на миллилитр. Затем мицин инкубирует ткань на вращающейся платформе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Затем кратковременно перебейте ткань в вихрь, а затем центрифугируйте при температуре от 200 до 400 раз G в течение двух минут, выбросьте надосадочную жидкость и добавьте свежий трипсин. И может ли мицин затем инкубировать ткань при 37 градусах Цельсия в течение одного часа при вращении. После инкубации переведите ткань в вихрь в течение 5-10 секунд.

Затем добавьте два миллилитра питательной среды, содержащей 10% FBS и 1% пенициллина стрептомицина. Чтобы дезактивировать трипсин, центрифугируйте клетки при температуре от 200 до 400 раз больше G в течение двух-трех минут. Затем выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте клеточную гранулу.

В двух миллилитрах питательной среды насыпьте клеточную суспензию на шестисантиметровую чашку для клеточной культуры и соскребите пластину для усиления прикрепления первичных клеток. Ежедневно контролируйте рост клеток с помощью светового микроскопа и меняйте питательную среду каждые два-три дня. Как только клетки достигнут уровня от 75 до 80%, используйте 0,05% или 0,25% трипсина, чтобы пройти через них, изолируя стромальные клетки эндометрия.

С помощью метода выскабливания генерируются кластеры рано возникающих клеток. Вдоль царапин, индуцированных скальпелем, стромальные клетки эндометрия могут быть идентифицированы по морфологии фибробластов. Метод трипсина имеет более длительное время приготовления, чем метод выскабливания, но жизнеспособные клетки наблюдаются раньше.

Метод триина также генерирует клетки как с кластерными, так и с дисперсными моделями роста. Тканеспецифический маркер стромальных клеток эндометрия до сих пор не обнаружен. Одним из способов идентификации стромальных клеток эндометрия является измерение потери маркера.

Для эпителиальных клеток, таких как цитокератин. Недостаток цитокератина свидетельствует об отсутствии эпителиальных клеток эндометрия. Потеря окрашивания цитокератином, наблюдаемая в пятом пассаже по сравнению со вторым, подтверждает отсутствие эпителиальных клеток.

Функциональные доказательства наличия стромальных клеток эндометрия могут быть получены с помощью анализа децеллюляризации. Увеличение пролактина и инсулиноподобного фактора роста, связывающего первый белок, в ответ на лечение CAMP и гидроксипрогестерона ацетатом указывает на успешное создание стромальной культуры эндометрия. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как установить первичные культуры стромальных клеток эндометрия из резецированной гистерэктомии.