Электропрядения фактор роста Освобождение микросфер в волокнистых Строительные леса

Этот протокол сочетает в себе электроспиннинг и микросферы для разработки тканевых каркасов для прямых нейронов. Фактор роста нервов инкапсулировали в микросферы PLGA и электровращали в волокнистые каркасы гиалуроновой кислоты (ГК). Биоактивность белка проверяли путем посева скаффолдов ганглиями спинного корня первичного цыпленка и культивирования в течение 4-6 дней.

Общая цель этой процедуры заключается в создании многогранной среды для поддержки роста и восстановления нервов. Это достигается путем инкапсуляции факторов роста в разлагаемые микросферы. Вторым шагом является подготовка вспомогательного материала для основной части окружающей среды.

Затем микросферы и поддерживающий материал объединяются и электровращаются в выровненный волокнистый каркас. Заключительным этапом является тестирование скаффолда с нейронами ганглиев дорсального корешка цыпленка. В конечном счете, иммунофлуоресцентная микроскопия используется для того, чтобы показать, что рост и направление нейритов ускоряются по сравнению с контрольной группой.

Хотя эта система предназначена для нервной ткани с небольшими изменениями используемых белков и материалов, она также может быть применена к различным типам тканей, включая сердце, легкие и кости. Перед началом этой процедуры приготовьте необходимые реагенты, 2% и 0,5% веса на объем растворов поливинилового спирта или ПВС в деионизированной воде, раствор 2% объема на объем, изопропиловый спирт и деионизированную воду, а также водный раствор желаемого гидрофильного белка. Место. 40 миллилитров 0,5%-ного раствора ПВС в 50-миллилитровую центрифужную пробирку и отложите в небольшой флакон 300 миллиграммов от 65 до 35 полимолочной согликолевой кислоты или PLGA и три миллилитра дихлорметана.

Для ускорения растворения PLGA может быть использован вихревой смеситель в сочетании с 200 микролитрами белкового раствора и четырьмя микролитрами 2%-ного раствора ПВА. Влейте белковую смесь ПВА в раствор PLGA. Решения останутся в основном отдельными.

Поместите флакон в стакан с ледяной водой с помощью Wator мощностью около 10 Вт, перемешивайте раствор в течение 5-10 секунд, пока не получится однородная кремово-белая эмульсия. Налейте эмульсию в заранее подготовленный 50 миллилитровый тюбик, содержащий 0,5% ПВА. Перемешивайте раствор на высокой скорости на вихревом смесителе в течение примерно 20 секунд.

Раствор приобретет мутный вид. Переложите эмульсию в стакан объемом 200 миллилитров и положите на тарелку для перемешивания при 350 об/мин на две минуты. Добавьте 50 миллилитров 2%-ного изопропилового спирта в стакан на тарелке для перемешивания.

Дайте смеси продолжать перемешивание в течение как минимум одного часа, чтобы хлорметан испарился, а PLGA затвердел. Далее переложите раствор микросферы в центрифужные пробирки, центрифугируйте при 425-кратном G в течение трех минут. Микросферы соберутся на дне пробирки и станут белыми Осторожно удалите надосадочную жидкость из пробирки над микросферами и храните в бутылке объемом 500 миллилитров.

Промойте микросферы деионизированной водой, заполнив каждую пробирку на три четверти и встряхнув ее, чтобы перераспределить микросферы в жидкости. Повторите центрифугирование, удаление надосадочной жидкости и промывку микросфер деионизированной водой четыре раза после окончательного промывки. Извлеките надосадочную жидкость и поместите в флакон объемом 500 миллилитров вместе с другими образцами.

Заморозьте собранные в пробирках центрифуги микросферы при температуре минус 20 градусов Цельсия на ночь, а затем лиофилизируйте не менее чем на 24 часа. Следующий электроспиннинговый раствор должен быть предварительно приготовлен в деионизированной воде, 2% веса на объем, связанной с метамфетамином гиалуроновой кислоте или miha с 3% веса на объем, 900 килодальтонном полиэтиленоксиде или PEO и 0,05% веса на объем. Решение для инициатора фотосъемки.

После изготовления нужного объема электровращающегося раствора добавьте микросферы в нужной концентрации до 400 миллиграмм на миллилитр. Перемешайте раствор на вихревом смесителе до тех пор, пока микросферы не равномерно распределятся в растворе. Перелейте раствор в шприц и прикрепите шестидюймовую иглу с тупым наконечником 18 калибра.

Поместите шприц в шприцевой насос и установите его дозирование на уровне 1,2 миллилитра в час. Наклейте слой алюминиевой фольги на оправку. Это позволяет легко очищать и хранить готовые строительные леса.

Вращающаяся оправка используется для создания выровненных волокон. Подключите провод заземления от высоковольтного источника питания к сборному устройству. Подсоедините положительный провод к игле для обеспечения успешного электроспиннинга.

Очень важно убедиться в правильности всех подключений и настроек. Запустите откачку полимера и когда раствор будет виден на конце шприца, включите источник напряжения и установите напряжение на 24 киловольта. Запускайте раствор до тех пор, пока не будет достигнута желаемая толщина каркаса.

По завершении выключите источник напряжения и шприцевую помпу. Чтобы начать эту процедуру, перед электроспиннингом прикрепите соответствующие защитные листы к области сбора электроспиннера с помощью съемного двустороннего скотча. Спиннинг на крышке скользит, облегчает обращение и просмотр после электроспиннинга до нужной толщины.

Как было показано в предыдущем видеосегменте, осторожно снимите защитные стекла с оправки. Поместите крышку лесов с покрытием в прозрачную азотную камеру и убедитесь, что весь кислород удален. Поместите камеру и каркас под 10 милливатт сантиметр квадратный 365 нанометровый свет на 15 минут.

После сшивания места крышка вставляется в лунку соответствующего размера. Убедитесь, что сторона лесов обращена вверх. Нанесите от 100 до 200 микролитров фильтрующего материала на каждый каркас в лунной пластине. Осторожно.

Поместите по одному ганглию дорсального корешка или DRG на каждый каркас в каплю фильтрующего материала. Для толстых лесов может потребоваться больше сред. ДРГ должна быть полностью погружена в воду и не плавать.

Инкубируйте каркас и DRG при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов, чтобы клетка могла прилипнуть к каркасу. Далее заполните наполнитель до соответствующего уровня для скважины. Верните планшет в инкубатор и инкубируйте в течение четырех-шести дней после инкубационного периода.

Осторожно извлеките носитель из каждой лунки и аккуратно промойте один раз PBS. Зафиксируйте ячейки на 30 минут, используя 4% веса на объем. Параформальдегид впоследствии окрашивает клетки для нейрофиламентов и ядер в соответствии с установленным протоколом.

Чтобы визуализировать клетки с помощью флуоресцентного микроскопа, поместите луночный планшет на предметный столик микроскопа и определите местоположение клеточной массы с помощью фильтра и настроек возбуждения для dpi. Как только ячейка будет определена, переключите фильтр в положение zi. Чтобы визуализировать протяженные невриты, используйте функцию сшивки на микроскопе, чтобы собрать и объединить столько изображений, сколько необходимо, чтобы увидеть всю структуру.

Повторите то же самое для dpi, fite и светлопольных микросфер. По этому протоколу постоянно производятся микросферы диаметром 50 плюс-минус 14 микрометров с инкапсуляцией более 85% белка, и электро вращаются в каркасы. На этом флуоресцентном изображении показаны репрезентативные микросферы с Rod Domine в оболочке PLGA и инкапсулированными внутрь BSA.

Для оценки инкапсуляции микросферы были заполнены БСА и протестированы на высвобождение белка в течение более 60 дней с помощью анализа белка Брэдфорда. Высвобождение начинается с первоначального всплеска, а затем продолжается, когда микросферы разрушаются после электровращения. Микросферы можно увидеть по всей трехмерной волокнистой структуре.

В этом SEM изображении всего каркаса. Сферы можно увидеть в нескольких слоях, обозначенных стрелками. На этом изображении с большим увеличением изображена одна микросфера с нановолокнами из каркаса над ней.

Ганглии дорсальных корешков или DRG были использованы для проверки жизнеспособности фактора роста нервов или NGF в микросферах внутри каркаса. Вот ДРГ сидят на эшафоте, содержащем микросферы. Загруженный NGF показан рядом с одной микросферой без белка внутри более длинного нейрита Расширения, отходящие от DRG на каркасе NGF, указывают на то, что NGF жизнеспособна и может способствовать росту.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как инкапсулировать белок в микросферы и встраивать их в волокнистые каркасы.