Класс-селективный Электропорация корковых интернейронов
18 августа 2014 г.
Эта процедура показывает, как нацеливаться на интернейроны в развивающемся переднем мозге мыши с помощью внутриутробной электропорации. Этот метод был особенно эффективен для достижения селективной экспрессии генов в подтипах интернейронов, предназначенных для поверхностных слоев коры головного мозга.
Общая цель данной процедуры заключается в воздействии на интернейроны развивающегося мозга мыши с помощью электропорации in utero. Для этого сначала подготавливают иглы для инъекций. Вторым этапом является извлечение эмбриона из анестезированного животного.
Затем в мозг проводят инъекцию ДНК и электропорацию. Заключительным этапом является период восстановления животного после хирургического вмешательства. В конечном счете, электропорация in utero используется для селективного воздействия на определенные подтипы интернейронов.
Преимущество этих методов по сравнению с нашими существующими методиками, такими как неспецифическая электропорация in utero, заключается в том, что они позволяют проводить автономный клеточный анализ подмножества кортикальных интернейронов. Высокий уровень экспрессии GFP обеспечивает визуализацию и анализ отдельных интернейронов. Данный метод может помочь в решении фундаментальных вопросов нейробиологии развития, например, о правилах, определяющих интеграцию созревающих интернейронов.
Для начала данной процедуры подготовьте пипетку для микроинъекций, вытянув стеклянный капилляр с помощью вытягивателя пипеток. Затем осторожно извлеките капилляр и отберите нижнюю иглу для микроинъекций. Теперь поместите анестезированную беременную мышь брюшной стороной вверх на нагревательную подложку.
Закройте морду маской, которая будет обеспечивать подачу изофлурана на протяжении всей операции. Затем нанесите глазную смазку на оба глаза. Установите температуру на грелке на 36 °C, чтобы предотвратить развитие гипотермии после вмешательства.
Проверьте отсутствие рефлексов стоп и хвоста, сжимая задние лапы или хвост. Затем очистите кожу на животе 70% ethanol. С помощью пинцета оттяните кожу вверх.
Затем сделайте небольшой вертикальный разрез длиной 2 см по срединной линии, начиная от середины между третьей и четвертой парами молочных желез. Осторожно, используя тупые пинцеты, следите за тем, чтобы не повредить брюшную стенку. Аккуратно извлеките эмбриональную цепь из полости.
Оставьте цепь лежать на влажных салфетках. Начните с обнажения одной половины матки. Затем проведите электропорацию эмбрионов, после чего переходите к другой половине.
В данной процедуре приготовьте раствор ДНК, растворив осадок, полученный в результате стандартного протокола макси-преп очистки, в дистиллированной воде. Затем добавьте в раствор ДНК краситель fast green в соотношении 1:20 для обеспечения визуализации во время инъекции. После этого с помощью тонкого пинцета срежьте кончик предварительно вытянутого микродозатора так, чтобы расстояние от начала расширения до конца кончика составляло 6 мм.
После этого наберите в микропипетку 1 µL раствора ДНК с красителем fast green для инъекции. Зафиксируйте голову эмбриона с помощью круглых пинцетов. Введите пипетку в мозг под углом 45°, целясь в боковой желудочек, расположенный рядом со срединной линией.
Если игла прошла сквозь желудочек, медленно вытяните пипетку. Желудочек должен окраситься в зеленый цвет, когда раствор начнет заполнять его. В этот момент прекратите движение пипетки и введите 1 µL ДНК.
Затем осторожно извлеките пипетку. Настройте аппарат ECM 830 на 5-45 вольтовых импульсов длительностью 50 миллисекунд с интервалом между импульсами 950 миллисекунд. Погрузите пятимиллиметровые пластинчатые электроды в PBS для обеспечения эффективной передачи тока.
Затем расположите электроды вокруг головы эмбриона так, чтобы положительный электрод находился над желудочком, содержащим раствор ДНК. Разместите положительный электрод немного ниже отрицательного, чтобы создать вентральный ток через ганглионарные выступы. Это позволит минимизировать эктопическую экспрессию в параметальных клетках.
Теперь подайте импульс, один раз нажав на ножную педаль, затем снимите электроды и протрите их дочиста. Повторите эти действия для каждого эмбриона. После проведения электропорации всех эмбрионов.
Влейте три миллилитра PBS в брюшную полость и верните эмбрионы обратно. Затем зашейте брюшную стенку с помощью изогнутой иглы и шелковой нити 5-0, после чего зашейте кожу. Нанесите лидокаин на рану и введите 120 мг/кг аспирина в качестве первичного обезболивающего средства.
Извлеките животное из анестезиологического контура и оставьте его для восстановления на грелке, застеленной бумажной салфеткой. После этого верните животное в клетку. Держите его на грелке при температуре 37 °C и контролируйте состояние здоровья.
В данном эксперименте электропорированные интернейроны определяются по экспрессии маркеров subtype-ов, производных от CGE. На этом изображении показано, что интернейроны, производные от CGE, электропорированы плазмидой DLX five six EGFP. На этом изображении представлен экспрессирующий VIP интернейрон на стадии P eight.
Экспрессия EGFP позволяет визуализировать всё дендритное дерево и аксональную сеть одиночных нейронов; здесь представлен NPY-экспрессирующий интернейрон на стадии P8. Экспрессия NPY очерчивает нейроглиальные клетки. Наконец, здесь показан NPY-экспрессирующий интернейрон на стадии P15.
После освоения эта техника может быть выполнена за 20 минут при правильном соблюдении протокола. Сочетая использование специфических плазмид и генетически модифицированных линий мышей, можно достичь временного и пространственного контроля экспрессии целевых генов. В некоторых экспериментах мы используем плазмиду A-D-L-X-T-T-A для индукции экспрессии AU-зависимых трансгенов.
В этих экспериментах мы подавляем экспрессию трансгена путем введения доксициклина.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе показано, как воздействовать на интернейроны в развивающемся переднем мозге мыши с помощью электропорации in utero. Этот метод позволяет обеспечить селективную экспрессию генов в подтипах интернейронов, предназначенных для поверхностных слоев коры.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Экспрессия генов
Теоретические основы
- Интернейроны играют важнейшую роль в функционировании коры головного мозга.
- Воздействие на специфические подтипы интернейронов может способствовать более глубокому пониманию их функций.
- Электропорация in utero является мощным методом генетической манипуляции.
- Данный метод позволяет точно контролировать экспрессию генов в развивающемся мозге.
Цель исследования
- Продемонстрировать метод воздействия на интернейроны переднего мозга мыши.
- Добиться селективной экспрессии генов в конкретных подтипах интернейронов.
- Предоставить протокол, который может быть воспроизведен в других исследованиях.
Используемые методы
- Подготовка игл для инъекций.
- Извлечение эмбриональной цепи из анестезированного животного.
- Инъекция ДНК в мозг.
- Электропорация для облегчения экспрессии генов.
Основные результаты
- Успешное воздействие на подтипы интернейронов в развивающемся переднем мозге.
- Эффективная экспрессия генов, достигнутая с помощью описанного протокола.
- Продемонстрированный потенциал для дальнейших исследований кортикальных интернейронов.
- Предоставлен надежный метод для будущих исследований в области нейробиологии развития.
Выводы
- Электропорация in utero является эффективным методом таргетного воздействия на интернейроны.
- Данный метод может быть использован для изучения функции генов в специфических популяциях нейронов.
- Протокол может быть адаптирован для различных вариантов экспериментального дизайна в нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Подтип-селективный таргетинг корковых интернейронов позволяет снизить механистические риски при валидации мишеней в нейроразвитии. Данный подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска, связывая генетические манипуляции с определенными популяциями нейронов. Это решает критическую задачу при отборе проектов в портфеле, поскольку биологическая специфичность снижает риск неудач на поздних стадиях разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы на определенных подтипах ГАМК-эргических интернейронов.
- Операционная ценность: обеспечивает снижение биологических рисков за счет функциональной валидации конкретных подтипов.
- Стратегическая ценность: повышает прогностическую уверенность и способствует приоритизации портфеля разработок путем изоляции причинно-следственных механизмов в системах, релевантных для данного заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений с разрешением по подтипам.
- Практическая ценность: Повышение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет экспрессии репортера с помощью электропорации.
- Стратегическая ценность: Обеспечение надежной оценки соединений в контексте нейронов, имеющих значение для изучения заболеваний.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает релевантность модели заболеванию за счет соответствия субтипов корковых интернейронов патофизиологии человека.
- Практическая ценность: Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации благодаря использованию единой стратегии таргетинга.
- Стратегическая ценность: Поддерживает принятие решений о продвижении разработки с учетом рисков, связывая взаимодействие с мишенью с фенотипическими исходами в определенных нейронных цепях.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в непрерывный процесс разработки — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки, что позволяет итеративно совершенствовать механистические модели.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей в подтипах корковых интернейронов.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа и получение количественных данных посредством экспрессии флуоресцентных репортеров в электропорированных клетках.
- Аналитика: предоставляет измеряемые показатели (например, интенсивность GFP, субклеточная локализация) для сравнения генетических или фармакологических условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями благодаря консервативным маркерам интернейронов у разных видов.
- Повторное использование в масштабе предприятия: служит многоразовой платформой для временного и пространственного контроля генов для множества мишеней и моделей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность, валидация мишени, снижение механистической неопределенности в путях нейроразвития.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость доставки генов в специфические подтипы клеток.
- Стратегическая ценность: Более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних этапах программ по ЦНС.
- Влияние на портфель: Приоритизация и решения по продвижению проектов с учетом рисков на основе взаимодействия с мишенью в специфических подтипах клеток.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области эмбриональной хирургии, микрохирургии и методов электропорации in utero.
- Зависит от специализированного оборудования, включая вытягиватели капилляров, электропораторы и системы флуоресцентной визуализации.
- Необходима межгрупповая стандартизация между специалистами по хирургии животных, молекулярной биологии и визуализации.
- Требуется учет особенностей адаптации для различных линий мышей, сроков гестации и плазмидных конструкций.
- Практические ограничения включают жизнеспособность эмбрионов после операции и вариабельность эффективности электропорации в разных пометах.
