Двухфотонное В естественных условиях Визуализация дендритных шипиков в мыши Cortex Использование разреженных черепа Подготовка

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить транскраниальную визуализацию, флуоресцентно меченные синаптические структуры в коре живой мыши с помощью двухфотонной микроскопии. Первым шагом после обезболивания мыши является выполнение подготовки истонченного черепа. Далее головка мыши обездвиживается с помощью изготовленной на заказ удерживающей пластины.

Затем через истонченный череп с помощью двухфотонной микроскопии получают стеки изображений. В конечном итоге, переезд и визуализация. Ранее изображенная область позволила проследить динамику дендритных шипиков в разные периоды времени при различных условиях.

Чтобы подготовиться к операции, сделайте мышь под наркозом кетамин и ксилазин и выполните щипцы ног, чтобы обеспечить полную анестезию. Затем поместите мышь на грелку и с помощью бритвенного лезвия побрейте голову. Протрите кожу чередующимися спиртовыми салфетками, чтобы простерилизовать выбритый участок и удалить остатки обрезков волос.

Также аккуратно нанесите глазную мазь на оба глаза. Далее сделайте прямой разрез по средней линии волосистой части головы и двигайте кожу в боковом направлении к краям черепа. Затем удалите соединительную ткань, прикрепленную к черепу, чтобы начать подготовку истонченного черепа.

Во-первых, определите желаемую область визуализации на основе ее относительного расположения по отношению к средней линии и bgma. Затем смочите череп солевым раствором, чтобы наблюдать за сосудистой сетью, чтобы избежать истончения черепа в области с крупными кровеносными сосудами, поскольку они блокируют проникновение света и размывают структуры изображения. После того, как выбрана область диаметром от 0,5 до 1 миллиметра, используйте высокоскоростное микросверло для истончения круглой области черепа.

Перемещайте сверло параллельно поверхности черепа, а не прижимайте его к черепу и прижимайте к нему, чтобы предотвратить повреждение, вызванное перегревом. Избегайте длительного контакта между сверлом и сверлом для черепа до тех пор, пока не будут удалены внешний компактный костный слой и средний слой губчатой кости. Затем с помощью микрохирургического лезвия, удерживаемого под углом примерно 45 градусов, утончите внутренний компактный слой кости в центре истонченной области сверла.

Соскребите череп, не прижимая к черепу, до тех пор, пока не получится равномерно истонченная область диаметром от 200 до 300 микрометров с толщиной примерно от 20 до 30 микрометров. Как только череп достаточно истончится, осторожно удалите остатки кости. Следующим шагом является крепление головной пластины, которая изготавливается из бритвенных лезвий с острыми краями, покрытыми лентами.

Начните с нанесения небольшой капли цианоакрилатного клея на каждый край центрального отверстия головной пластины. Затем центрируем пластину на истонченном участке. Крепко прижмите его к черепу.

Теперь аккуратно потяните кожу от боков черепа к краям центрального отверстия головной пластины. Удерживайте пластину на месте в течение одной-двух минут. Затем подождите еще восемь-девять минут, пока головная пластина хорошо прикрепится к черепу.

Через 10 минут поместите пластину для головы на два боковых блока удерживающей пластины. Далее затяните винты по краям пластины головки, чтобы обездвижить мышь на удерживающей пластине. Посмотрите на голову мыши через препарирующий микроскоп, осторожно поглаживая спину мыши, чтобы убедиться, что голова правильно обездвижена.

Затем промойте открытый череп солевым раствором, чтобы удалить любой неполимеризованный клей, чтобы переместить ранее изображенную область. На последующих сеансах визуализации сделайте фотографию сосудистой сети истонченной области обнаженного черепа, которая обозначена как карта номер один. Затем поместите мышь под микроскоп и найдите истонченную область под объективом с 10-кратным воздушным сжатием.

Используя эпифлуоресценцию, переместите самую тонкую область к центру изображения. Теперь добавьте каплю физраствора на верхнюю часть черепа и переключитесь на цель 60 крат. Выберите область, где отдельные дендритные шипики четко визуализируются вдоль дендритов.

Определите и надпишите соответствующую область на первой карте, сравнив сосудистую сеть между эпифлуоресцентным изображением и фотографией сосудистой системы. Затем настройте длину волны двухфотонного лазера в соответствии с флюорочетверками. Затем с помощью объектива 60 x получают стеки изображений с двумя микрометрическими шагами вдоль оси Z, охватывающие область примерно 200 микрометров на 200 микрометров.

Она обозначена как вторая карта и используется для перемещения дендритного сегмента изображения во время последующих сеансов визуализации. Теперь получите девять стеков изображений на второй карте с помощью трехкратного цифрового зума. Каждая стопка изображений покрывает приблизительную площадь 70 микрометров на 70 микрометров с шагом 0,7 микрометра по оси Z.

После визуализации аккуратно отделите пластину головы от черепа. Далее с помощью микрохирургического лезвия удалите остатки клея с черепа. Затем несколько раз промыть череп и кожу солевым раствором и зашить кожу головы стерильными хирургическими швами.

Во время восстановления держите животное на грелке в отдельной клетке и вводите подкожно анальгетик бупренорфин при послеоперационных болях. После полного выздоровления верните животное к домашнему датчику Чтобы повторно получить изображение дендритов в другой день, сделайте животное анестезией и обнажите череп. Как и раньше, повторите иммобилизацию головы, установив пластину для головы и прикрепив ее к удерживающей пластине.

Затем найдите ранее изображенную область, сравнив рисунок сосудистой сети с первой картой и рисунок дендритной ветви с картой 2. Если повторная визуализация проводится в течение одной недели, тонкий слой вновь выросшая кость может быть удален с помощью микрохирургического лезвия. Если повторная визуализация проводится через неделю, сначала используйте микробор, а затем микрохирургическое лезвие для истончения черепа.

Теперь отрегулируйте положение и ориентацию под двухфотонным микроскопом, чтобы получить стеки изображений, которые соответствуют ранее сделанным стекам изображений. После получения изображений дайте мыши восстановиться и вернуть ее в клетку, как и раньше, а изображение сосудистого узора, окружающего тонкую область черепа, обозначенную как карта номер один, используется для обращения ко всем последующим сеансам визуализации. Черным ящиком обозначена область, где были получены два фотонных изображения in vivo.

Это изображение дендритных ветвей в моторной коре головного мозга месячной мыши обозначено как карта два. В белом поле показан дендритный сегмент, выбранный для визуализации. Со временем было сделано два фотонных снимка одного и того же дендритного сегмента на нулевой день, второй день, четвертый день и восьмой день.

Вновь образованные колючки. То есть шипы, которых не было на предыдущем сеансе визуализации, показаны стрелками, шипы, которые были удалены между сеансами визуализации, показаны стрелками. Филипп Подиа обозначается звездами после освоения.

Эту технику можно выполнить за один-два часа, если она выполнена правильно.