Поведенческая Фенотипирование мышиный Disease Models с интегрированной поведенческой станции (INBEST)
23 апреля 2015 г.
Длительное и комплексный мониторинг мышей в условиях домашнего клетке обеспечивает более глубокое понимание девиантным поведением в мышиных моделях заболеваний головного мозга. Эта статья описывает интегрированную поведенческой станции (INBEST) в качестве ключевого компонента современной поведенческого анализа.
Общая цель данной методологии заключается в улучшении воспроизводимости и стандартизации поведенческого фенотипирования и экспериментальных мышей путем непрерывного мониторинга основных поведенческих показателей в привычной среде. Эта модульная система состоит из оцифрованного компьютеризированного бегового колеса с сеткой для скалолазания, автоматизированного дозатора еды, двух управляемых фотоэлементами TER, управляемого компьютером светового стимула и укрытия, сторонних компонентов и инфракрасной технологии MPEG четыре, интегрированных с видеослежением и записью событий, программные пакеты сопряжены для создания восьми арен, что позволяет осуществлять одновременный мониторинг четырех экспериментальных и четырех контрольных животных. Задержки, частоты и продолжительность определенного поведения анализируются с помощью программного обеспечения MED PC 4.
В то время как локомоторная активность и топография траекторий движения оцениваются с помощью программного обеспечения ETH ovision XT 8.5 с использованием комплексного статистического анализа. Данные часто обрабатывались для выявления поведенческих изменений, вызванных прогрессированием заболевания в различных моделях мышей. Сложный и чувствительный характер поведения часто делает надежные измерения у хронически больных мышей очень трудными.
Использование новых технологий, которые позволяют проводить точный, непредвзятый поведенческий анализ. Мы описываем специально созданную систему мониторинга под названием Inves или Integrated behavioral station. Этот аппарат предназначен для обеспечения длительных измерений основных функциональных показателей, таких как спонтанная активность, потребление пищи и воды, эмоциональная реактивность, мотивированное поведение, и все это в обстановке с низким уровнем стресса, подобной домашней.
К основным преимуществам Invest по сравнению с одиночными поведенческими тестами относятся непрерывный мониторинг, снижение нагрузки при транспортировке и быстрый сбор нескольких наборов данных, которые мгновенно передаются для объективного компьютерного анализа. Несмотря на то, что непрерывный мониторинг устраняет проблемы, распространенные в традиционных исследованиях, важно отметить, что некоторые области поведения, такие как неврологические функции и пространственное обучение, не могут быть изучены в условиях домашней клетки, что требует дополнительных тестов. Начните приучать мышей к циклу от 12 до 12 от света к темноте. Мыши наиболее активны в ночное время.
Установите временной интервал темного цикла так, чтобы он был параллелен рабочим часам экспериментатора. Все остальные факторы окружающей среды, такие как температура и вентиляция, должны оставаться постоянными в течение этого периода. Для постоянной цифровой идентификации сделайте татуировку хвоста мыши за пять-семь дней до тестирования.
Регулярно прикасайтесь к мышам до двух часов в день, тем самым приучая их к измерению стресса и записи массы тела, ректальной температуры и заметок их общего вида. Исключите из исследования мышей, у которых наблюдаются грубые аномалии, такие как низкое потребление пищи или воды, потеря массы тела, сгорбленная осанка, взъерошенная или покрытая пятнами шерсть, гидроцефалия или выделения порфирина вокруг глаз. Кроме того, в течение этого периода времени может быть проведен широкий спектр поведенческих тестов, таких как в открытом поле, что позволяет получить более полное представление о дефиците производительности.
Для длительного поведенческого исследования в диспенсере для еды должен быть полный запас гранул мышиного чау. Каждый весом 20 миллиграмм. Одна бутылка всегда должна быть наполнена свежей водой из-под крана.
В тесте предпочтений вторая бутылка может обеспечить альтернативное решение, представляющее интерес, например, содержащее сахар. Взвесьте флаконы, чтобы оценить объем, потребляемый между сеансами. Чтобы измерить латентность и частоту употребления алкоголя, носики бутылок должны быть прикреплены к TER.
Инфракрасный датчик обнаруживает облизывание, поэтому убедитесь, что датчик не заблокирован форсункой носика. Если это так, измените длину носика, чтобы он помещался в клетку. Укрытие должно быть размещено в углу, расположенном дистальнее бегового колеса.
Для видеослежения необходимо, чтобы помещение освещалось приглушенным рассеянным светом, который не отражается от вложенного в него пола или стен. После правильной настройки освещения испытательная арена может быть оцифрована для испытательного программного обеспечения. Для этой демонстрации для настройки арены используется программный пакет ETH Ovision XT 8.5.
Начните с открытия проекта отслеживания по умолчанию и ввода экспериментальных настроек. Затем выберите источник видео, в данном случае прилежный граббер piccolo. Установите количество арен слежения равным четырем.
Выберите центральный нос и хвост для точек отслеживания, а затем выберите единицы измерения Next из списка испытаний. В меню настройки укажите количество пробных версий, нажав кнопку «Добавить пробные версии». Затем переключите параметр добавления переменной, чтобы указать независимые переменные, такие как идентификатор мыши, группа пола, назначение и штамм.
Теперь сделайте захват фонового изображения арены, щелкнув вкладку настроек арены и определив периметр арены с помощью доступных инструментов рисования После того, как арена будет определена, используйте опцию добавления зоны, чтобы очертить зоны интереса, такие как пол, TER, диспенсер для еды и так далее. Затем добавьте зоны, в которых мышь не видна, с помощью опции добавить группу скрытых зон. Это включает в себя укрытие и беговое колесо.
Каждая скрытая зона также должна иметь указанную точку входа. После определения периметра и зон каждой арены выполните калибровочные тесты с помощью опции калибровки в программном обеспечении. Используйте инструмент доступа к масштабам, чтобы определить ширину и длину каждой арены.
Затем проверьте настройки каждой арены с помощью кнопки «Подтвердить» и перейдите к настройке параметров испытания и сбору данных. Для получения данных данные необходимо предварительно задать параметры сбора данных в программе. Начните с перехода на вкладку настроек управления пробной версией и указания временных рамок для пробного набора.
Условие начала начинается, когда продолжительность центральной точки превышает одну секунду на арене, продолжительность испытания устанавливается путем развертывания поля условия остановки и установки завершения испытания после заданной задержки, такой как 10 часов, теперь выберите вариант из метода обнаружения на вкладке настроек обнаружения. Затем захватите эталонное изображение пустой арены, используя кнопку настроек и выбрав Захватить ток, еще находясь в модуле обнаружения, отрегулируйте диапазон контрастности для центральных точек обнаружения носа и хвоста. Установите непрерывный диапазон.
Затем укажите, что мышь ярче или темнее фона. Теперь отрегулируйте настройку размера объекта, которая зависит от поля зрения камеры. Затем, при необходимости, отрегулируйте количество кадров в секунду анализа в зависимости от того, на что способен компьютер.
Обработка 14.9 кадров. Второго обычно достаточно. Когда все изменения будут внесены в параметры модуля обнаружения, обязательно сохраните их, прежде чем приступать к измерению задержки, частоты и продолжительности поведенческих действий.
Специально созданная процедура в MED PC 4 используется для пошагового ввода параметров сеанса, таких как идентификатор мыши, продолжительность пробной версии, схватки за ходовые колеса и так далее. Когда все эти параметры введены и все испытательное оборудование включено, перейдите к размещению мыши на арене. Затем синхронизируйте пакеты видео и отслеживания событий, одновременно нажимая кнопки записи, и тихо покиньте комнату позже, когда истечет период записи, верните мышей в их домашние клетки, измерьте вес бутылок и сохраните все записанные данные на цифровых носителях.
Необработанные данные могут быть выведены в электронную таблицу для анализа, а необработанные видеофайлы могут быть оценены на предмет нечастого поведения, такого как стереотипы или припадки. Длительное исследование на мышах с использованием БК 1 с использованием метода в лучшем случае было проведено за несколько дней до операции. Были собраны исходные данные, за которыми последовали послеоперационные данные, которые включают устойчивое внутрижелудочковое введение реактивных антител головного мозга.
Начиная с пятого дня, экспериментальные группы показали различные нарушения, включая снижение облизывания бутылок с водой. Они также показали повышенную латентность при приближении к бутылкам с раствором сукралозы, а также снижение потребления пищи. Одновременно с этими изменениями, мыши, которым вводили реактивные антитела в мозг, также показали снижение активности бегового колеса по сравнению с контрольными мышами.
В опытной группе обработанные мыши предпочитали проводить время в укрытиях. Используя эти данные, была построена простая рограмма, чтобы проиллюстрировать эти поведенческие различия. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как настроить индивидуальный аппарат мониторинга для непредвзятого поведенческого анализа.
В домашних условиях, автоматизированное фенотипирование в домашних клетках предоставляет большой объем информации, позволяющей более точно оценить кинетику начала и тяжесть поведенческих дефицитов, вызванных заболеванием, связанных с поведением, мотивированным спонтанной локомоцией, и эмоциональной реактивностью, сводя к минимуму проблемы, связанные с непостоянными условиями окружающей среды, транспортировкой, стрессом и повторяющимися манипулятивными аппаратами, такими как inves, может значительно повысить согласованность и точность поведенческих результатов. в отдельных исследованиях.
Обзор
В данном исследовании представлена интегрированная поведенческая станция (Integrated Behavioral Station, INBEST) — модульная система, разработанная для комплексного мониторинга мышей в условиях домашней клетки. Целью системы является повышение воспроизводимости и стандартизации поведенческого фенотипирования на мышиных моделях заболеваний головного мозга.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Поведенческий анализ
- Экспериментальная методология
Теоретическая база
- Поведенческое фенотипирование имеет решающее значение для понимания заболеваний головного мозга.
- Традиционные методы часто включают транспортировку животных, вызывающую стресс.
- Непрерывный мониторинг в привычной среде может дать более надежные данные.
- Сложные формы поведения трудно точно измерить у больных мышей.
Цель исследования
- Разработать систему для длительных и объективных поведенческих измерений.
- Снизить уровень стресса, связанного с традиционным поведенческим тестированием.
- Облегчить одновременный сбор нескольких наборов поведенческих данных.
Используемые методы
- Использование цифрового бегового колеса с сетчатым покрытием и автоматических дозаторов корма.
- Интеграция программного обеспечения для видеотрекинга и регистрации событий для анализа данных.
- Оценка таких поведенческих показателей, как локомоторная активность и эмоциональная реактивность.
- Применение протоколов габитуации для адаптации мышей к условиям тестирования.
Основные результаты
- Непрерывный мониторинг выявил поведенческие изменения, связанные с прогрессированием заболевания.
- Обработка данных позволила провести комплексный статистический анализ поведения.
- Специализированные системы мониторинга предоставили данные о спонтанной активности и мотивированном поведении.
- Некоторые показатели поведения, такие как неврологические функции, требуют дополнительного тестирования вне домашней клетки.
Выводы
- INBEST повышает надежность поведенческого анализа на мышиных моделях.
- Непрерывный мониторинг снижает влияние сопутствующих переменных, характерных для традиционных исследований.
- Модульность системы обеспечивает гибкость в настройке экспериментальных установок.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Поведенческое фенотипирование на мышиных моделях имеет решающее значение для валидации мишеней при разработке препаратов для ЦНС, однако традиционные методы вносят вариативность из-за стресса, манипуляций с животными и нестабильности условий окружающей среды. Интегрированная поведенческая станция (INBEST) решает эти проблемы, обеспечивая непрерывный мониторинг основных функциональных показателей непосредственно в домашней клетке, что повышает надежность и воспроизводимость данных. Это способствует снижению механистических рисков и повышению прогностической уверенности на ранних этапах разработки за счет получения лонгитюдных количественных показателей поведения, которые отражают прогрессирование заболевания в условиях низкого стресса.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем длительного измерения спонтанной активности, потребления пищи/воды и мотивированного поведения на моделях заболеваний.
- Операционная ценность: сокращает количество вмешивающихся факторов, связанных с транспортировкой и повторными манипуляциями, что повышает согласованность данных между экспериментальными группами.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет фиксации лонгитюдных поведенческих изменений, связанных с патогенными механизмами, что помогает в оценке достоверности выбранной мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать стандартизированные количественные наборы поведенческих данных (латентный период, частота, продолжительность), подходящие для приложений высокопроизводительного скрининга.
- Операционная ценность: Облегчает подготовку анализа за счет автоматизированного сбора данных и интеграции с программным обеспечением для видеотрекинга и регистрации событий (например, MED PC, ETHovision).
- Масштабируемость: Модульная конструкция позволяет осуществлять одновременный мониторинг нескольких животных (например, четырех экспериментальных и четырех контрольных), что увеличивает пропускную способность и возможность повторного использования платформы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: позволяет оценивать кинетику развития и степень тяжести вызванных заболеванием поведенческих нарушений, что соответствует прогрессированию клинических симптомов при расстройствах ЦНС.
- Механистическое снижение рисков: дает представление об эмоциональной реактивности и мотивированном поведении, помогая соотнести доклинические результаты с клиническими ожиданиями.
- Признанные ограничения: оценка неврологических функций и пространственного обучения требует проведения дополнительных тестов вне домашней клетки, что делает необходимым использование дополнительных анализов для полного поведенческого профилирования.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
INBEST вписывается в континуум открытий — от ранней валидации мишеней до оптимизации ведущих соединений, что особенно актуально для фенотипов ЦНС, где поведенческие конечные точки определяют решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go). Метод дополняет последующие доклинические исследования, обеспечивая создание надежных моделей исходного состояния и прогрессирования заболевания.
- Фундаментальная биология: Поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей путем мониторинга спонтанной активности и мотивированного поведения в качестве индикаторов функционирования нейронных цепей.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые временные ряды поведенческих показателей, которые позволяют проводить сравнение между различными генотипами, вариантами терапии или стадиями заболевания.
- Аналитика: Генерирует обрабатываемые потоки данных (с помощью MED PC и ETHovision) для статистического анализа поведенческих тенденций, что позволяет проводить межгрупповые сравнения и оценивать величину эффекта.
- Трансляционные исследования: Соответствует стратегиям поиска биомаркеров за счет отслеживания функциональных показателей, коррелирующих с тяжестью заболевания, что помогает принимать обоснованные решения о переходе к следующим этапам исследований с учетом рисков.
- Корпоративное использование: Модульная и стандартизированная конструкция позволяет внедрять метод в нескольких исследованиях и центрах, снижая вариативность при настройке и обеспечивая гармонизацию данных между проектами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов за счет снижения механистической неоднозначности поведенческих фенотипов благодаря непрерывному объективному мониторингу.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию за счет автоматизированного сбора данных, минимизации человеческого вмешательства и контролируемых условий окружающей среды.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя надежные лонгитюдные поведенческие данные, что снижает вероятность неудач на поздних стадиях из-за недостаточной валидации мишени.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию соединений на основе анализа рисков, обеспечивая согласованные поведенческие показатели, которые отражают взаимодействие с мишенью и функциональные результаты.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области поведенческой нейробиологии, систем видеотрекинга и программного обеспечения для анализа данных (например, MED PC, ETHovision).
- Метод зависит от интегрированного оборудования: оцифрованного бегового колеса, автоматических дозаторов корма и воды, фотоэлементных датчиков, инфракрасного видеозахвата и систем контроля окружающей среды.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов привыкания, циклов свет/темнота и методов идентификации животных (например, татуирования хвоста) для обеспечения сопоставимости данных.
- Адаптация для различных моделей может потребовать корректировки определений зон, размещения датчиков и поведенческих этограмм в зависимости от вида, линии или фенотипов, специфичных для конкретного заболевания.
- Практическое ограничение: невозможность оценки таких сложных форм поведения, как пространственное обучение или неврологические функции, непосредственно в домашней клетке, что требует проведения дополнительных тестов для комплексного профилирования.
