Функция контроля и морфология сосудистой Завербован факторов, секретируемых быстрорастущих опухолевых генерирующих клеток

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы с помощью ультразвука и эндомикроскопии проиллюстрировать ангиогенный потенциал пула факторов, секретируемых раковыми клетками. Это достигается путем первичной имплантации пробки для создания опухолеподобной среды у мыши в отсутствие опухолевых клеток. Затем оценивается плотность кровеносных сосудов и процент функциональных кровеносных сосудов в пробке.

На заключительном этапе визуализируется морфология кровеносных сосудов. В конечном счете, баланс между проангиогенными и антиангиогенными факторами, секретируемыми клетками, и их влияние на ангиогенез могут быть оценены интенциально, жизненно и в различные моменты времени с помощью двух взаимодополняющих методов визуализации. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как обычный анализ матригельной пробки, заключается в том, что он позволяет анализировать пул секретируемых клетками факторов с использованием дополнительных прижизненных методов визуализации.

Чтобы использовать ультразвук для оценки внеклеточного матрикса или васкуляризации гелевой пробки ЭКМ, начните с помещения одной 1,5-миллилитровой эйноровой трубки, содержащей 80 микролитров свежеприготовленной кондиционированной среды, на лед. Самая сложная часть процедуры – это введение геля без пузырьков с помощью ледяных насадок. Бережное перемешивание и медленный впрыск обеспечат оптимальное введение геля.

Затем с помощью ледяных 1000 микролитров советов смешайте 600 микролитров ледяного холода четырех градусов Цельсия на ночь. Размороженный гель для имитации ЭХМ в среду следят за тем, чтобы не образовывались пузыри. После подтверждения седации путем щипкования пальцев ног побрейте брюшную полость каждой мыши и используйте ледяной одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 27 калибра, чтобы медленно подкожно.

Вводите содержимое одной пробирки EEND DPH на каждое животное. После того, как будет введен весь объем, удерживайте иглу на месте в течение нескольких минут, пока не произойдет застывание. Через три недели снова побрейте область живота мышей, удалив лишние волосы с помощью крема для депиляции, а затем зафиксируйте мышей в лежачем положении на сцене микроманипулятора.

Далее наполните одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 30 калибра, физиологическим раствором. Затем поместите иглу внутрь хвостовой жилы. Крепко зафиксируйте иглу и ослабьте шприц.

Теперь поместите преобразователь в центр нужной области сканирования и нажмите «3D», чтобы инициализировать 3D-моторную сцену. Нажмите кнопку 3D. Снова введите расстояние сканирования и размер шага и нажмите кнопку «Сканировать».

Убедитесь, что на отображаемом 3D-изображении была отсканирована вся вилка. Если нет, отрегулируйте датчик так, чтобы был виден весь разъем, и отсканируйте область еще раз, как показано выше. Затем выберите контраст и отрегулируйте компенсацию усиления по времени или регуляторы tgc, чтобы затемнить изображение, используйте микшер для активации микропузырьков на 45 секунд.

Затем смешайте 50 микролитров микропузырьков с 50 микролитрами физиологического раствора в одном миллилитровом шприце. Замените разрыхляющий шприц, содержащий физиологический раствор, на шприц, содержащий активированные микропузырьки, и введите разведенные микропузырьки в хвостовую вену каждой мыши. Подождите несколько секунд, пока пузырьки не станут устойчивыми, а затем нажмите «3D» и выберите «Сканировать» для получения 3D.

Изображения с повышенным контрастом. Нажмите «Просмотренный магазин», чтобы сохранить данные изображения, а затем выберите «3D» и «Уничтожить 3D». Чтобы уничтожить микропузырьки, нажмите «3D» еще раз и выберите «Сканирование», чтобы получить петлю cena после разрушения.

Затем снова нажмите «Увидел магазин». Затем в настройках эталона нажмите кнопку Создать ссылку, а затем выберите Управление исследованием. Чтобы открыть цикл cena перед разрушением.

Теперь нажмите кнопку обработки cena, чтобы создать наложение зеленого контраста. Затем выберите «Загрузить в 3D» в программном обеспечении для ультразвуковой визуализации. Далее нажмите настройки режима, нажмите громкость и выберите параллельный.

Затем сегментируйте серию контуров, чтобы создать 3D-объем целевой ткани, и нажмите «Готово», чтобы завершить сегментацию. Для использования волокнистой конфокальной эндомикроскопии для оценки морфологии сосудистой сети ЭКМ, имитирующей гелевую пробку, вводят 200 микролитров 10 мг на миллилитр, помещают меченый С декстран в хвостовую вену каждого экспериментального животного. Затем сделайте небольшой разрез примерно в одном сантиметре от пробки и аккуратно поместите эндомикроскопический зонд поверх пробки, сохраняя пробку нетронутой.

Как только щуп будет на месте, используйте ножную педаль для нажатия пускового лазера. Как только на экране появится флуоресценция, нажмите кнопку выбора ножной педалью для получения коротких до 32-х длинных видеороликов между фильмами, промойте наконечник щупа в трубке с водой. Когда съемка будет закончена, очистите наконечник ватным тампоном, чтобы проанализировать средний диаметр сосуда.

Затем нажмите на «Обнаружить микрососуды», чтобы открыть окно модуля обнаружения сосудов, и нажмите «Настройки». Убедитесь, что средний диаметр сосуда указан в интересующей статистике. Помечаются столбцы гистограммы окна и дисплея в режиме отображения.

Нажмите «Обнаружить», чтобы отобразить выбранные измерения. Для того чтобы проанализировать интенсивность флуоресцентного сигнала в областях, прилегающих к кровеносным сосудам, выберите «Создать круг ROI» и «Создать круг в интересующей области». Наконец, выберите Вычислить гистограмму в ROI, чтобы вычислить значения, относящиеся к обведенной области.

Здесь обширное задействование функциональных кровеносных сосудов в кондиционированных средненагруженных пробках с дозой 87 мг выявляется с помощью ультразвуковой визуализации, усиленной микропузырьковым контрастом. И наоборот, в пробках, содержащих кондиционированную среду из спящих клеток, генерирующих опухоль, кровоток практически не обнаруживается. Морфология этих вновь образованных кровеносных сосудов дополнительно подчеркивается волоконной конфокальной эндомикроскопией сосудов после введения fit c dextran, как показано на этих репрезентативных изображениях, обратите внимание, как кровеносные сосуды внутри пробок, загруженных кондиционированной средой U 87 мг, демонстрируют типичную морфологию расширенных сосудов с негерметичным тупым концом.

Расширенные и сильно запутанные кровеносные сосуды также демонстрируют ненепрерывный и вялый поток, а утечка крови наблюдается в окружающей области, о чем свидетельствует высокий флуоресцентный сигнал, видимый за пределами кровеносных сосудов. После освоения эта техника может быть выполнена за несколько часов в несколько временных точек для оптимизации кинетики ангиогенеза.