Понимание начале Органогенез, используя упрощенную

Общая цель данного эксперимента — показать, в каких частях целого эмбриона экспрессируется конкретный ген. Это достигается путем фиксации РНК, подлежащей локализации, непосредственно внутри эмбриона на втором этапе. Антисмысловой РНК-зонд, специфичный к исследуемому гену, гибридизируется с целевой РНК внутри эмбриона.

Этот зонд содержит эпитоп, обычно дигогенин, который затем может быть обнаружен. Далее антитело, конъюгированное с щелочной фосфатазой, гибридизуется с эпитопом на РНК-зонде, после чего используется колориметрический краситель. Для визуализации локализации РНК в эмбрионе получают результаты, которые на основании цветовой реакции и знаний об анатомии эмбриона точно показывают, где экспрессируется интересующий ген.

Основное преимущество протокола нашего института по сравнению с существующими протоколами заключается в том, что он требует меньше времени и реагентов без заметного снижения качества. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы эмбриологии, такие как механизмы спецификации и паттернирования тканей. Хотя данный метод дает представление о развитии opus, он также может быть использован для многих других мелких эмбрионов, например, эмбрионов данио-рерио или мышей на ранних стадиях развития.

Мы начали разработку этих методов, поскольку исходные методики требовали значительных временных затрат; в связи с этим мы приступили к экспериментам по пропуску этапов Ed для повышения эффективности процедуры без потери качества. Фиксация эмбрионов проводится поэтапно. Сначала подготовьте стеклянные флаконы, которые будут использоваться на всех этапах, включая окончальное хранение эмбрионов, чтобы обеспечить возможность мониторинга эмбрионов на всех стадиях процесса.

Используйте прозрачные флаконы с надежной тефлоновой прокладкой в крышке; подпишите флаконы с помощью перманентного маркера, указав соответствующую информацию об эксперименте. Заклейте этикетку прозрачной лентой, чтобы предотвратить стирание надписей в ходе выполнения процедуры. В связи с использованием спиртов и других растворителей, приготовьте фиксирующий раствор MFA согласно описанию в тексте протокола.

Наполните каждую промаркированную стеклянную виалу тремя-четырьмя миллилитрами раствора MFA. Храните 100% раствор метанола при температуре -20 °C. Изготовьте стеклянную пипетку с обрезанным кончиком и используйте ее для переноса эмбрионов в стеклянные виалы с раствором Memphis для фиксации.

Перенесите эмбрионы, стараясь минимизировать объем переносимой среды для эмбрионов. Поместите в каждый флакон не более 20–30 эмбрионов. Оставьте эмбрионы в растворе Memphis на два часа при комнатной температуре на ротаторе.

По завершении фиксации параформальдегидом замените раствор Memphis примерно четырьмя миллилитрами 100% метанола, охлажденного до −20 °C, для хранения эмбрионов. Перед подготовкой реакции синтеза зонда дайте смеси ДНК, воды и NTP, а также полимеразному буферу нагреться до комнатной температуры. Одним из наиболее критических этапов для успеха данной процедуры является правильная подготовка реакционной смеси для синтеза зонда.

Соберите реакционную смесь для синтеза зонда при комнатной температуре. Добавьте следующие компоненты в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл в указанном порядке: матричную ДНК, воду до достижения общего объема реакции 20 µL, смесь NTP, ингибитор РНК, буфер для РНК-полимеразы и РНК-полимеразу. Инкубируйте реакцию транскрипции в течение двух часов при 37 °C.

Инкубация чуть дольше двух часов не оказывает негативного влияния, но также практически не приводит к увеличению выхода; при инкубации в течение одного часа выход снижается, хотя его все еще достаточно для создания качественного зонда. По завершении реакции транскрипции отберите один микролит реакционной смеси для проверки на 1% агарозном геле в TAE. Остальную часть реакционной смеси...

Добавьте 80 µL 1% SDS в буфере TE, 10 µL 5 M ацетата аммония и 220 µL холодного этанола. Интенсивно перемешайте смесь на вортексе и поместите на лед до получения результатов проверки качества РНК. После добавления воды и стандартного красителя для нанесения к 1 µL РНК, отобранной до осаждения, проведите электрофорез РНК в 1% агарозном геле с TAE и бромидом этидия.

Визуализируйте меченую бромидом этидия РНК на геле с помощью УФ-трансиллюминатора, чтобы проверить качество зонда. Должна быть видна одна четкая полоса без шлейфов выше или ниже нее. После подтверждения качества РНК осадите оставшуюся РНК, которую держали на льду, центрифугировав ее в микроцентрифуге на максимальной скорости в течение 10–15 минут.

Удалите супернатант с помощью длинной стеклянной пипетки и дайте РНК слегка подсохнуть. Затем зонд ресуспендируют в буфере для гибридизации РНК и хранят в полистирольной пробирке с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл при температуре -20 °C. Для начала этой процедуры извлеките эмбрионы, хранившиеся в метаноле при -20 °C, и дайте им нагреться до комнатной температуры.

Вся процедура проводится в стеклянных флаконах. Если разные эмбрионы из одной группы будут исследованы с помощью разных зондов, держите их в одном флаконе до момента добавления зондов. Чтобы уменьшить вариабельность и трудозатраты в первый день подготовки к добавлению зонда, проведите регидратацию эмбрионов через серию метанола, как указано в этой таблице; используйте стеклянные пипетки для осторожного удаления и добавления каждого раствора, так как на этом этапе эмбрионы могут быть легко повреждены.

При переносе жидкостей проверяйте внутреннюю сторону крышек, чтобы убедиться, что там не остались эмбрионы. После каждой замены осторожно перемешивайте эмбрионы круговыми движениями, чтобы они не прилипали к стенкам или друг к другу. Поместите пробирки с эмбрионами на ротатор для перемешивания перед использованием; при этом буфер для гибридизации РНК и зонд должны быть предварительно нагреты до 65 °C.

Проводите гибридизацию эмбрионов в растворе зонда в течение ночи, а на следующий день — при перемешивании на качалке при 65 °C. Удалите раствор зонда и перенесите его в полистирольную пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл, пометив ее датой и количеством использований зонда. Храните раствор зонда при -20 °C.

После удаления зонда подготовьте эмбрионы к окрашиванию антителами против зонда, проведя серию промывок в соответствии с данным описанием; при необходимости измените температуру, переместив мутатор с закрепленными на нем пробирками с эмбрионами непосредственно в гибридизационные печи, установленные на соответствующий температурный режим. Пока эмбрионы инкубируются в блокирующем растворе, приготовьте необходимый объем блокирующего раствора с добавлением антител anti-D dig, чтобы обеспечить блокировку антител перед их добавлением к эмбрионам. Инкубируйте эмбрионы в растворе антител в течение ночи при температуре 4 °C в режиме медленного перемешивания (раскачивания), после чего переходите к следующим этапам на следующий день.

Удалите раствор антител и промойте образец раствором mab, содержащим малеиновую кислоту и хлорид натрия. Выполните как минимум 1230-минутные промывки при комнатной температуре в режиме качания. Замените последний промывочный раствор субстратом щелочной фосфатазы.

Проводите реакцию окрашивания при комнатной температуре в течение ночи на качалке, завершив её на следующий день. Остановите реакцию окрашивания и подготовьте эмбрионы к хранению и визуализации, заменяя растворы согласно данной таблице. После регидратации эмбрионов зафиксируйте окрашивание с помощью MFA в течение 30 минут.

После фиксации извлеките MFA и промойте эмбрионы 25% methanol. Если требуется удаление эндогенного пигмента, удалите 25% methanol и добавьте обесцвечивающий раствор. Внимательно следите за процессом обесцвечивания, так как оно происходит относительно быстро; степень обесцвечивания можно варьировать для достижения различных эффектов.

Для длительного хранения дегидратируйте эмбрионы в серии растворов метанола до 100% метанола. После обесцвечивания для краткосрочного хранения и последующей визуализации перенесите эмбрионы в PBS. Непросветленные эмбрионы лучше всего рассматривать и снимать на 1% фоне aros. Чтобы приготовить раствор aros, добавьте aros в воду и доведите до кипения, пока aros полностью не растворится. После того как раствор aros остынет до 50 °C, налейте его в чашку Петри слоем толщиной около двух миллиметров.

Когда чашка Aros будет готова, поместите в нее необработанные эмбрионы и приступайте к получению изображений. Aros создает сине-серый фон, который хорошо контрастирует с эмбрионом и синим цветом реакции окрашивания. Он также помогает рассеивать мешающие тени и блики, отвлекающие внимание от эмбриона, что позволяет визуализировать его с разных сторон, например, с вентральной стороны.

С помощью тонкого пинцета сделайте надрезы в кольце, чтобы оно подходило по размеру эмбриону. Поместите эмбрионы в эти каналы для ориентации. Будьте осторожны при манипуляциях с эмбрионами, так как они легко повреждаются.

Используйте оптоволоконный источник света для освещения эмбриона под небольшим углом; создаваемые таким образом тени придают изображению глубину и помогают распознать поверхностные структуры, так как обесцвечивание может удалить пигмент, служащий важным ориентиром. Используйте метод создания теней для сильно обесцвеченных эмбрионов. Прозрачные эмбрионы используются для визуализации окрашивания глубоких структур, таких как пуповина, легкие или области головного мозга.

В данном протоколе используются различные степени обесцвечивания для визуализации окрашивания в эмбрионе. При интенсивном окрашивании более мягкое обесцвечивание, сохраняющее часть пигментации, позволяет лучше определить стадию развития и ориентацию эмбриона. Однако, если окрашивание сосредоточено в области с высокой степенью пигментации, например, в почках, лучший результат дает более интенсивное обесцвечивание.

Манипуляции с основанием ARO могут помочь в ориентации эмбриона. Например, путем прорезания узкого канала в ARO эмбрион на стадии головастика, лежащий на боку, можно перевернуть брюшной стороной вверх с достаточной стабильностью для получения качественного изображения. Данный эмбрион был помещен в небольшое отверстие, которое стабилизировало его положение брюшной стороной вверх, что позволило полностью визуализировать паттерн экспрессии интересующего гена.

Внутренние органы можно наблюдать как в неочищенных, так и в просветленных эмбрионах; на данном примере представлен неочищенный непрозрачный эмбрион, окрашенный на PAX 2. На 34-й стадии можно визуализировать зрительный стебель, а также нервную трубку. Однако детали выглядят нечеткими. После просветления эмбриона границы зон экспрессии, включая зрительный стебель, становятся более резкими.

Степень просветления видна по тому, что в этом эмбрионе можно различить оба глаза. Однако распространенной проблемой при просветлении эмбрионов является накопление красителя во внутренних полостях. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как быстро провести гибридизацию in situ на целом препарате с использованием меньшего количества реагентов и получить высококачественные изображения.