Понимание начале Органогенез, используя упрощенную На месте Гибридизация Протокола в Xenopus

Общая цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы показать, где определенный ген экспрессируется в интактном эмбрионе. Это достигается за счет фиксации РНК, которая должна быть локализована на месте в эмбрионе в качестве второго шага. Зонд антисмысловой РНК, специфичный для интересующего гена, гибридизуется с целевой РНК внутри эмбриона.

Этот зонд содержит эпитоп, обычно дигогенин, который затем может быть обнаружен. Затем антитело, связанное с щелочной фосфатазой, гибридизуют с эпитопом на РНК-зонде, после чего используют колорметрическое окрашивание. Для того, чтобы визуализировать, где локализована РНК в эмбрионе, получаются результаты, которые точно показывают, где экспрессируется интересующий ген, основываясь на цветовой реакции и знании анатомии эмбриона.

Основное преимущество нашего протокола института перед существующими заключается в том, что он быстрее и использует меньше реагентов без видимой потери качества. Этот метод может ответить на ключевые вопросы эмбриологии, такие как определение и структурирование тканей. Хотя этот метод может дать представление о развитии опуса, он также может быть использован для многих других маленьких эмбрионов, таких как рыбки данио и ранние эмбрионы мышей.

Мы впервые начали разрабатывать эти методы, потому что первоначальные методы занимали много времени, и мы начали экспериментировать с оставлением этапов Ed, чтобы повысить эффективность процедуры без ущерба для качества. Фиксация эмбриона проводится поэтапно. Во-первых, подготовьте стеклянные флаконы, которые будут использоваться на всех этапах, включая окончательное хранение эмбрионов, чтобы обеспечить мониторинг эмбрионов на всех этапах процесса.

Используйте прозрачные флаконы с хорошим тефлоновым уплотнением в крышке с помощью перманентного маркера, маркируйте флаконы соответствующей экспериментальной информацией. Наклейте этикетку прозрачной лентой, чтобы предотвратить потерю маркировки в ходе процедуры. В связи с использованием спиртов и других растворителей приготовьте раствор для фиксации MFA, как описано в тексте протокола.

Наполните каждый стеклянный флакон с этикеткой тремя-четырьмя миллилитрами раствора MFA. Хранить раствор 100% метанола при температуре минус 20 градусов Цельсия. Сделайте хрустальную пипетку и с ее помощью перенесите эмбрионы в стеклянные флаконы, содержащие раствор Мемфиса для фиксации.

Добавляйте зародыши с минимальным переносом жидкости из зародышевой среды. Фиксируйте не более 20-30 эмбрионов на одну мерзость. Оставьте эмбрионы в растворе Мемфиса на два часа при комнатной температуре на мутаторе.

По завершении фиксации параформного альдегида замените раствор Мемфиса примерно четырьмя миллилитрами при температуре минус 20 градусов Цельсия. 100%-ный метанол для хранения эмбрионов перед сборкой зонда реакции синтеза, дайте ДНК водной смеси NTP и полимеразного буфера нагреться до комнатной температуры. Одним из наиболее важных шагов для успеха этой процедуры является правильная сборка реакции зонда.

Соберите зонд для реакции синтеза при комнатной температуре. Добавьте следующие компоненты в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра в указанном порядке. Матричная ДНК воды доведена до объема, который доводит общий объем реакции до 20 мкл. Смесь NTP, ингибитор РНК, буфер РНК-полимеразы и РНК-полимераза инкубируют реакцию транскрипции в течение двух часов при 37 градусах Цельсия.

Инкубация чуть дольше двух часов, не имеет побочных эффектов, но также показывает небольшое увеличение выхода, если инкубировать в течение одного часа, выход будет снижен, хотя все еще достаточен для получения хорошего зонда. Когда реакция транскрипции завершена, удалите один микролитр реакционной смеси для проверки на 1%aros. TAE гель к оставшейся реакционной смеси.

Добавьте 80 микролитров 1%SDS в TE-буфер, 10 микролитров ацетата пяти моляров аммония и 220 микролитров холодного этанола. Энергично перебейте смесь и отложите ее на лед до тех пор, пока не станут известны результаты проверки качества РНК. После добавления воды и стандартного загрузочного красителя к одному микролитру РНК, удаленному перед осаждением, запустите РНК на 1%-ном геле TAE, содержащем бромид AUM.

Просмотрите РНК, меченную бромидом атерия, на геле с помощью транслюминатора ультрафиолетового излучения, чтобы проверить качество зонда. Следует визуализировать одиночную полосу без размазывания ни выше, ни ниже нее. После того, как качество РНК будет проверено, осадите оставшуюся РНК, которая была отложена на льду, вращая в микроцентрифуге на полной скорости в течение 10-15 минут.

Удалите надосадочную жидкость с помощью вытянутой стеклянной пипетки и дайте РНК ненадолго высохнуть. Затем зонд ресуспендируют в буфере для гибридизации РНК и хранят в полистирольной трубке объемом 15 миллилитров при температуре минус 20 градусов Цельсия. Чтобы начать эту процедуру, извлеките эмбрионы, которые хранились при температуре метанола минус 20 градусов по Цельсию, и дайте им нагреться до комнатной температуры.

Вся процедура выполняется в стеклянных флаконах. Если разные эмбрионы из одной группы будут исследоваться разными зондами, храните их в одном флаконе до тех пор, пока зонды не будут добавлены. Чтобы уменьшить вариабельность и трудоемкость в первый день подготовки к добавлению зонда, регидратируйте эмбрионы с помощью серии метанола, как указано в этой таблице, используйте стеклянные пипетки для извлечения и осторожного добавления каждого раствора, так как эмбрионы могут быть легко повреждены на этом этапе.

При переносе жидкостей проверьте внутреннюю часть крышек, чтобы убедиться, что эмбрионы не попали в ловушку. Аккуратно перемешивайте эмбрионы после каждой смены, чтобы они не прилипали к бокам или друг к другу. И покачивайте эмбрионы, устанавливая флаконы на мутатор перед использованием буфера для гибридизации РНК, и зонд должен быть предварительно предупрежден до 65 градусов Цельсия.

Гибридизируйте эмбрионы в зондовом растворе в течение ночи с укачиванием при температуре 65 градусов Цельсия на следующий день. Извлеките раствор щупа и сохраните его в полистирольной трубке объемом 15 миллилитров с завинчивающейся крышкой, на которой указана дата и количество использований зонда. Храните раствор зонда при температуре минус 20 градусов Цельсия.

После извлечения зонда подготовьте эмбрионы к окрашиванию антителами к зонду с помощью серии промывок, как описано здесь, измените температуру по мере необходимости, переместив мутатор с прикрепленными флаконами эмбрионов непосредственно в гибридизационные печи, которые установлены на соответствующую температуру. В течение того времени, когда эмбрионы инкубируются в блокирующем растворе, восполните соответствующий объем блокирующего раствора плюс антитело против D dig, чтобы антитело блокировалось до его добавления в эмбрионы. Инкубируйте эмбрионы в растворе антител в течение ночи с покачиванием при температуре четыре градуса Цельсия на следующий день.

Удалите раствор антител и промойте мабом, раствором, который содержит малеиновую кислоту и хлорид натрия. Выполнять стирки не менее 1230 минут при комнатной температуре с покачиванием. Замените последний раствор для промывки щелочным фосфатазным субстратом.

На следующий день проведите реакцию окрашивания при комнатной температуре с покачиванием на ночь. Остановите реакцию окрашивания и подготовьте эмбрионы к хранению и визуализации, изменив жидкости, как указано в этой таблице. После регидратации эмбрионов зафиксируйте пятно с помощью MFA на 30 минут.

После фиксации удалите MFA и промойте эмбрионы 25% метанолом. Если требуется удаление эндогенного пигмента, удалите 25% метанол и добавьте отбеливающий раствор. Внимательно наблюдайте за обесцвечиванием, так как оно происходит относительно быстро, а степень обесцвечивания может варьироваться для различных эффектов.

Для длительного хранения обезвоживайте эмбрионы с помощью метанола до 100% метанола после обесцвечивания для кратковременного хранения и последующей визуализации, переносите эмбрионы в PBS Неочищенные эмбрионы лучше всего рассматривать и визуализировать на фоне 1%. Чтобы приготовить раствор арос, добавьте арос в воду и доведите до кипения, пока арос не окажется в растворе. После того как арос остынет до 50 градусов по Цельсию, вылейте его в чашку Петри на глубину около двух миллиметров.

Когда блюдо арос будет готово, поместите в него неочищенные эмбрионы и приступайте к визуализации. Арос дает серо-голубой фон, который хорошо контрастирует с эмбрионом и синим цветом реакции окрашивания. Он также помогает рассеивать отвлекающие тени и отражения, которые отвлекают внимание от эмбриона на изображение эмбриона с альтернативной стороны, например, с вентральной стороны.

Используйте тонкие щипцы для надрезов в области волос, чтобы они соответствовали эмбриону. Поместите эмбрионы в эти каналы для ориентации. Будьте осторожны при манипуляциях с эмбрионами, так как они легко повреждаются.

Используйте волоконно-оптический источник света, чтобы освещать эмбрион под небольшим углом, создавая тени на эмбрионе, которые придают глубину изображению и помогают различить поверхностные структуры, потому что обесцвечивание может устранить пигмент, который обеспечивает полезные ориентиры. Используйте затенение для сильно обесцвеченных эмбрионов. Очищенные эмбрионы используются для визуализации окрашивания, которое находится глубоко внутри эмбриона, например, в области спинного мозга, легких или областей мозга.

В этом протоколе используются различные уровни обесцвечивания для визуализации окрашивания у эмбриона. Если пятно сильное, более легкое отбеливание, оставляющее некоторую пигментацию, позволяет улучшить стадию и ориентацию эмбриона. Однако, если пятно находится в области с высоким уровнем пигментации, например, в почках, большее обесцвечивание дает лучший результат.

Манипуляции с основанием ARO могут помочь в ориентации эмбриона. Например, при вырезании тонкого канала в аросе эмбрион на стадии тад-полюса, лежащий на боку, может быть виден с вентральной стороны с достаточной стабильностью для получения хорошего изображения. Этот эмбрион был помещен в небольшое отверстие, которое стабилизировало его положение вентральной стороной вверх, что позволило полностью увидеть паттерн экспрессии интересующего гена.

Внутренние органы могут быть осмотрены как у неочищенных, так и у очищенных эмбрионов у непрозрачного эмбриона, окрашенного для PAX 2. На стадии 34 можно визуализировать зрительный стебель, а также нервную трубку. Тем не менее, детали не являются четкими При очистке эмбриона границы мимических участков, включая зрительный стебель, становятся более четкими.

Степень очищения проявляется в способности видеть оба глаза у этого эмбриона. Тем не менее, общая проблема с очищенными эмбрионами заключается в том, что во внутренних полостях накапливается некоторое количество окрашивания. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как быстро выполнить целую монтировку на месте с меньшим количеством реагентов и получить высококачественные изображения.