Озвучивание при содействии Иммунофлуоресцентное Окрашивание поздней стадии эмбрионального и личиночного Drosophila Ткани На месте

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации или насыщении тканей в C-2 с помощью флуоресцентной микроскопии после ультразвуковой обработки. Это достигается путем сбора образцов эмбрионов и личинок, а затем их фиксации с помощью формальдегида, гептана и метанола. Вторым шагом является ультразвуковая обработка неподвижного образца с целью удаления кутикулы для обеспечения проникновения антител.

Далее на образец наносится иммуноокрашивание первичными и флуоресцентными вторичными антителами. Заключительным этапом является установка образца в раствор Антифа на основе глицерина. В конечном счете, конфокальная или эпифлуоресцентная микроскопия используется для визуализации развивающейся ткани, а также экспрессии и локализации белка.

Основное преимущество этой методики перед другими методами, такими как диссекция тканей, заключается в том, что она позволяет визуализировать различные развивающиеся ткани. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что этап ультразвуковой обработки зависит от ряда факторов для достижения максимальной эффективности, включая правильное позиционирование ультразвукового зонда. Демонстрировать процедуру будут Эшли Фиддлер и Лорен Боул, два талантливых студента-исследователя из моей лаборатории.

Чтобы начать эксперимент, осторожно удалите эмбрионы, собранные на агаровой пластине, с помощью небольшой кисточки, соединенной с фосфатным буфером Triton X 100 или раствором PBTX. Затем протрите кистью с образцом о внутренний выступ сетчатого фильтра. Поместите крышку чашки Петри под ситечко камеры.

Затем промойте кисть и стенки ситечка с помощью пульверизатора, содержащего PBTX. После того, как образец будет перенесен в сетчатый фильтр, налейте в него достаточное количество PBTX, чтобы поднять образец с сетки. Повторите этот шаг три раза, чтобы удалить дрожжи и отходы жизнедеятельности мух, удалить PBTX.

Затем налейте в ситечко 50% раствор отбеливателя и дайте личинкам посидеть в растворе пять минут. Далее удалите раствор. Затем промойте образец PBTX и дайте образцу постоять в растворе в течение трех минут.

Повторите этот шаг пять раз, просушите дно ячейки ситечком. Затем с помощью кисти, соединенной с PBTX, переложите образец в сцинтилляционный флакон, содержащий 1,75 миллилитра пэм. В вытяжной шкаф добавьте 250 микролитров 37% формальдегида и восемь миллилитров реагента.

Добавьте гептан в сцинтилляционный флакон и встряхните флакон при 200 об/мин в течение 20 минут. Затем добавьте 10 миллилитров метанола в сцинтилляционный флакон, не удаляя водную фазу, и энергично встряхните при 500 об/мин. После встряхивания сразу же вылейте содержимое в ячейку ситечка над контейнером для жидких отходов.

Добавьте в флакон дополнительное количество метанола и пропустите содержимое через сетчатое фильтр. Чтобы убедиться, что весь образец был удален. Попробуйте протереть дно клеточного фильтра лабораторной салфеткой.

Затем с помощью кисти перенесите образец из сетчатого фильтра в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 0,5 миллилитров метанола. Подождите, пока образец осядет. Затем извлеките метанол с помощью пипетки и замените его свежим 0,5 миллилитром метанола.

Повторите этот шаг три раза и добавьте последние 0,5 миллилитра метанола в тюбик перед хранением при температуре минус 20 градусов по Цельсию. На последующий срок воспользуйтесь функцией извлечения сохраненного образца из морозильной камеры и извлечения метанола с помощью пипетки. Затем добавьте в трубку один миллилитр 50% метанолфосфатного буферного твин или раствора PBTW и покачивайте трубку в течение трех минут.

Затем промойте образец одним миллилитром PBTW дважды, дав образцу отстояться, прежде чем оттянуть PBTW с помощью пипетки, добавьте в флакон 1,0 миллилитра бычьего сывороточного альбумина фосфата или BBTW и покачивайте в течение трех минут. Дайте образцу осесть и извлеките BBTW с помощью пипетки. Повторите этот шаг два раза.

Позаботьтесь о том, чтобы удалить как можно больше BBTW без потери образца. Затем добавьте в тюбик 0,5 миллилитра BBTW и положите его на лед. Затем установите ультразвуковую обработку на максимальную амплитуду 10% и время работы две секунды с постоянной нагрузкой, очистите зонд атора, поместив наконечник зонда в коническую трубку объемом 50 миллилитров, заполненную деионизированной водой, и запустите ультразвуковую обработку.

Затем высушите зонд для ультразвука лабораторной салфеткой. Погрузите зонд в трубку, расположенную на три-четыре миллиметра над образцом, и начните ультразвуковую обработку. Затем извлеките пробирку и поместите ее на лед на 30 секунд, чтобы предотвратить перегрев от ультразвуковой обработки и дать образцу осесть на дне пробирки.

Повторите этот шаг в соответствии с возрастом образца после завершения ультразвуковой обработки. Промойте образец два раза одним миллилитром BBTW. После каждого полоскания дайте образцу осесть, прежде чем высушить BBTW С помощью пипетки добавьте один миллилитр BBTW в флакон и поместите его на коромысло.

Через три минуты дайте образцу осесть и извлеките BBTW с помощью пипетки. Затем повторите это. Сделайте два шага, заблокируйте образец 0,5 миллилитрами 5% нормальной сыворотки, разведенной в BBTW, до пробирки и поместите образец на коромысло на один час при комнатной температуре.

Далее добавьте 0,5 миллилитра первичного раствора антитела и раскачайте образец на ночь при температуре четыре градуса Цельсия, дайте образцу осесть на дно пробирки. Затем отоберите первичные антитела с помощью пипетки и дважды промойте одним миллилитром BBTW. Добавьте в флакон один миллилитр BBTW, а затем поставьте его на коромысло на три минуты.

Затем извлеките BBTW с помощью пипетки и повторите это. Сделайте пять шагов, заблокируйте образец 5%-ным раствором обычной сыворотки BBTW и покачивайте его в течение 30 минут. Затем удалите раствор.

Добавьте вторичное антитело, разведенное на 5% в обычном сывороточном растворе BBTW, и оберните тюбик алюминиевой фольгой. Затем сожмите образец на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Отоберите вторичные антитела с помощью пипетки и дважды промойте образец одним миллилитром PBTW.

Далее добавьте в флакон один миллилитр PBTW и поставьте его на коромысло на пять минут. Затем дайте образцу осесть и извлеките PBTW с помощью пипетки. Повторите это.

Шаг три раза. Добавьте от 80 до 100 микролитров раствора DAB co в тюбик и храните его при температуре минус 20 градусов Цельсия. Наконец, чтобы установить образец, используйте от пяти до 10 микролитров капюры капюры BCO p lene diamine или PPD anti fade.

Затем просмотрите его с помощью флуоресцентной микроскопии. Эти Z-проекции четырех конфокальных срезов демонстрируют эффективность протокола для визуализации морфологических особенностей, а также отдельных клеток в C-2 на поздних эмбриональных и ранних и средних стадиях развития дрозофилы. Развитие яичек является особенно хорошей системой для иллюстрации эффективности протокола, поскольку созревание яичек динамично на протяжении всего развития личинки.

На этих изображениях выделены зародышевые клетки в красных и центральных клетках, а зоны FU — в зеленых одиночных конфокальных срезах среднего L-трех мозгов. Иммуноокрашивание ганглиозных материнских клеток, недифференцированных нейронов в зеленых и незрелых и первичных нейронах. Красным цветом показано сильное окрашивание с отчетливыми паттернами экспрессии в долях мозга и вентральном нервном канатике, в зависимости от ориентации крепления, визуализация позволяет визуализировать ткани мозга с дорсальной поверхности, вентральной поверхности или в сагиттальном сечении.

Этот метод in situ two позволяет биологам исследовать развитие органов в морфогенезе тканей у организмов, где защитная кутикула препятствует проникновению антител. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить ультразвуковую обработку и иммуноокрашивание образцов пищевода эмбрионов и личинок на поздних стадиях, чтобы визуализировать развивающиеся ткани в С-2. Не забывайте, что работа с формальдегидом, гептаном и метанолом может быть чрезвычайно опасной, а меры предосторожности, такие как работа в вытяжном шкафу.

При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать правила ношения соответствующих перчаток и лабораторного халата.