Name: Оценка Виды-конкретный вклад в черепно-лицевой развития Использование Перепела-утки химер (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Изучите метод создания химерных эмбрионов перепела и утки для исследования роли клеток нервного гребня в черепно-лицевом развитии. Этот подход позволяет выявить видоспецифические механизмы морфогенеза.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Эта работа финансировалась по Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований (NIDCR) F32 грант (DE021929) к JLF и безвозмездной NIDCR R01 DE016402 к РАН

1. Подготовьте вольфрама Иглы <ol><li> Вырежьте вольфрама стержень в половине используя кусачки, чтобы стержень не гнется. </li><li> Заправьте стержень через коническим концом 5 3/4 в боросиликатного стекла пипетки Пастера. </li><li> Оставляя примерно 3/4 в часть стержня, торчащие из стекла, придерживаться стержень в пипетки с небольшим борта &quot;клея-расплава&quot; (HMA), который является клей-карандаш используется для клеевой пистолет. НМА следует быстро плавится в пламени спирта, стараясь не сжечь клей и генерировать черный дым. </li><li> Используя пару щипцов, не согнуть кончик вольфрамового стержня (около 1/4 от верхнего конца), пока угол в 45 ° достигается. </li><li> Держа пипетку Пастера, разместить около 1/8 дюйма из кончика вольфрамового стержня в пламя пропановой горелки. Держите кончик устойчивый и строго перпендикулярно к пламени. </li><li> Вытащите иглу из пламени момент крошечный оранжевый пятнышко tungsдесять улетает иглы. </li></ol> 2. Подготовьте Спеманн Пипетки <ol><li> Использование горелку, нагрейте узкий конец пипетки Пастера, пока стекло вскоре за конусом не начнет таять. Удалить из пламени и вытащить кончик до пипетка не становится опечатаны. Убедитесь, что остается часть конической части, которая имеет наружный диаметр примерно 0,7-1,0 мм. Перерыв запечатанный конец от примерно 4 см от конуса. </li><li> Прикрепите около 2 футов (60 см) резиновой трубки с широким (открытой) конца пипетки. Удар на другом конце резиновой трубки для того, чтобы воздух не может проходить через конической части пипетки Пастера. </li><li> Использование пропан топлива цилиндр с прикрепленным факела пламени карандаш, нагревают овальную область на одной стороне пипетки чуть ниже начала конуса. Подайте воздух очень мягко и постоянно через резиновую трубку с небольшим количеством давления (примерно Величина давления нужно было сказать о начале Letteг &quot;Р&quot; на уровне разговора). Когда стекло становится мягким на одной стороне и начинает пряжки наружу, быстро удалить пипетку от пламени и удар жесткий и устойчивый через резиновую трубку. Это приведет к тому подогревом часть стекла, чтобы сформировать колбасу-образный пузырь, которые могут неожиданно, и это хорошо. Если пузырек слишком мала, попытайтесь снова плавления и дуть стекло. Окончательный открытое окно в стекле должна быть около 0,25 в (6,35 мм) в ширину и 0,5 в (12,7 мм) в длину. </li><li> Указывая клиновидный конец вверх, очищайте купол в стеклянную контейнер для отходов, мягко дует через трубопровод, чтобы предотвратить фрагментов стекла ввода пипетки. </li><li> Использование пламени пропана, сжечь оставшиеся края пузыря и пожар-отполируйте бокам открытое окно. Будьте осторожны, не растопить вал пипетки. </li><li> Использование точку алмаз карандаш, забить конический конец пипетки около 1.25 в (30 мм) от окна и разорвать кончикпинцетом, так что отверстие пипетки аккуратно обрезаны (отбрасывают пипетки с разбитыми или неровных кончиков). </li><li> Использование щипцов и край пламени из спирта горелки, согнуть узкую часть пипетки 0,375 в (9,5 мм) от кончика до углом примерно 60 ° так, чтобы изогнутая часть находится в вертикальной плоскости, когда отверстие окно находится на 1:00 позиции для правшей использования и 11:00 для левого использования. Этот шаг лучше всего проводить в проекте без корпуса. </li><li> Противопожарные польский кончик используя пламя алкоголя при вскрытии микроскопом. Убедитесь, что не закрыть кончик, а держать круглый открытие и гладкой без сужения. </li><li> Отрежьте 1 в (25 мм) кусок резиновой трубки, спрей кусок трубы с 70% этанола, и сдвиньте трубку на вал пипетки до открытия окна не полностью покрыта. Это функционирует как &quot;диафрагмы&quot; пипетки Спеманн. </li><li> Поставьте мл лампочку латексный каучук 2на открытом дне пипетки. Колба поддерживает отрицательное давление в пипетку Спеманн. </li><li> Для практики с помощью пипетки Спеманн, передача хроматографии бусинки вокруг 100-200 мкм в диаметре от заметному место в одной чашке Петри к заметному месте в другой под микроскопом. </li><li> Для очистки пипетку Спеманн, снимите резиновую грушу и место пипетки чаевые вниз, в высокий стакан выложены ваты или марли на дне и с дистиллированной водой и посуды моющим средством. </li></ol> 3. Стерилизовать и инкубировать яйца <ol><li> Протрите яйца с 70% этанола и поместите яйца на пластиковых лотках яичных. </li><li> Установите яйца в инкубаторе с подогретым на 37,5 ° С и 85-87%. </li><li> Выдержите яйца, пока они не достигнут HH9.5, около 26 час для перепелов и 48 часов для утки. </li></ol> 4. Окно яйца <ol><li> Удалить небольшой кусочек внешней оболочки из верхней части яйца щипцами, стараясь не проколоть внутреннюю оболочку мembrane. </li><li> С помощью шприца с 18 г на 1-дюймовым иглы, сделать дырку в самом узком кончике яйца и вывести приблизительно 1-2 мл белка. </li><li> Поместите прозрачную ленту над отверстием и марки прокола в оболочке. </li><li> Вырезать &quot;окно&quot; вдоль верхней поверхности яйца (через прозрачную пленку), используя изогнутые ножницы. </li></ol> 5. Визуализация эмбрионов и подготовиться к операции <ol><li> Использование стеклянной палочки, аккуратно чистить небольшое количество нейтрального красного (0,02 г / мл в BSS Хэнка) над эмбриона. </li><li> Вырезать желточной оболочки и вытяните ее над эмбриона с использованием пламени заточены вольфрамовой иглы. </li><li> Re-запечатать яйцо, поместив прозрачную ленту над окном. </li></ol> 6. Отделите Tissue доноров из эмбрионов доноров <ol><li> Снимите ленту из окна на яйца донора эмбриона. </li><li> Чтобы вырезать нейронной раз по сравнению с соседней эктодерме доноров эмбрионов, сделать прорези на обоих д.ЭС нервной трубки, с помощью пламени заточены вольфрама иглу (изготовленного, как описано выше). </li><li> Затем пересекают нервной трубки в нужных передней и задней уровней трансплантата и отделить трансплантат от остальной части нервной трубки. </li><li> Удалить нейронной раза от доноров эмбрионов с использованием либо пипетки Спеманн или другой тип микропипетки. </li><li> Затем удалите ленту из окна на хост-яйцо и использовать пипетку Спеманн поместить донорскую нейронной раз наряду с принимающей эмбриона, прилегающей к области нервной трубки, которая получит пересадку. </li></ol> 7. Отделите ткани хозяина и пересадке ткани доноров <ol><li> Отделите нейронной раз из нервной трубки принимающей эмбриона, как это было сделано с донором. Позаботьтесь, чтобы удалить трансплантат одинакового размера, как донорской ткани. </li><li> Аккуратно нажмите эту ткани хозяина далеко от эмбриона. </li><li> Затем, с помощью тупой иглы вольфрама или закругленного кончика миcropipette, осторожно двигаться донор нейронная раза в хост нервной трубки, поддержание надлежащего передне-задней и спинно-вентральной ориентации. Убедитесь, что трансплантат заправил по сторонам, но будьте уверены, не тыкать или повреждения подлежащих тканей. Чтобы помочь отслеживать из исходной ориентации записке любую асимметрию в донорской ткани или дифференциального окрашивания от нейтрального красного. Мы также фото-документ донор эмбрион с прилагаемыми вырезали ткани, а также химеры сразу же после операции. </li><li> Стерильный физиологический раствор должен быть добавлен к яйца, если хост эмбрион показывает признаки высыхания. </li><li> Теперь вновь тщательно печать и маркировать яйцо и осторожно вернуть ее в инкубаторе с высокой влажностью (70-80%), где химерный эмбрион может развиться до нужной стадии для анализа. </li></ol> 8. Сборник химерами <ol><li> Будьте уверены, что собирать химерных эмбрионов в свежеприготовленный фиксатором холодной Серра и сразу разместить их на роCKER при 4 ° С для фиксации O / N. Это позволит более чувствительного обнаружения перепелиных клеток с анти-перепелиным антитела. </li><li> Для экспрессии генов анализирует через RT-КПЦР, заморозить эмбрионы непосредственно в жидком азоте до выделения РНК. </li></ol>

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Нервного гребня является переходным эмбриональных клеточная популяция, что мигрирует широко по всему эмбриону и дифференцируется в разных типах клеток, включая хондроциты и остеобласты, которые вносят вклад в черепно-лицевой скелет. Пересадка нервного гребня в перепела-утки химерных системы внесла большой вклад в наше понимание тканей взаимодействий и передачи сигналов, регулирующих развитие черепно-лицевой скелет. Однако, учитывая огромный потенциал нервного гребня также генерировать гладкомышечных клеток, адипоциты, меланоциты, Шванн клетки и нейроны, система химера перепела-утка имеет огромный потенциал для будущих приложений, особенно в сочетании с быстрым развитием биологии стволовых клеток и регенеративная медицина. Поскольку перепела и утки являются коммерчески разводят видов, готовая поставка относительно недорогих оплодотворенных яиц доступна из различных хозяйств. Таким образом, этот метод должен быть доступен для Researcее эксплуатации в широком диапазоне бюджетов и объекта пространстве. Хотя этот метод является очень мощным, остаются некоторые ограничения. Как и другие хирургические методы, качество и жизнеспособность перепела-утки химер полагаться на хирургических навыков исследователя, и поэтому, будет больше меж-и внутри-индивидуальные различия между экспериментами по сравнению с другими моделями, такими как те, с использованием мыши генетика. Кроме того, есть также различия в темпах развития и этапы отдельных эмбрионов, которые способствует воспроизводимости и успеха каждого трансплантата. Эмбрионов птиц также очень чувствительны к обезвоживанию и, следовательно, критические шаги во время операции включают сохраняя уровень освещенности низкий, время под микроскопом до минимума, яйца запечатанные с лентой как можно больше, и высокая влажность в послеоперационном инкубатора в избежать высыхания. С точки зрения жизнеспособности химер, Uвенно между 50-75% выжить, хотя эти проценты могут снизить старше этапе сбора. В типичной 4-6 ч сессии хирургии, опытный хирург может генерировать 10-15 химеры. Успех трансплантации также в значительной степени зависит от качества инструментов. Хорошие инструменты привести к более последовательной, воспроизводимых результатов. Использование пропановой горелки, чтобы сделать вольфрама иглы позволяет чрезвычайно острые иглы должны быть сделаны. Тип фонарика используется делает большой разницы, потому что он контролирует размер пламени. Электролитические заточка также может быть использован, но этот подход даже не приблизились к производству игл столь резким. Используйте стержни вольфрама вместо буферного проволоки так, чтобы иглы может сделаться прямым. Спеманн микропипетка, в то время как много времени и трудно сделать, является идеальным инструментом для передачи ткани. Пипетка могут быть настроены с различного размера отверстия, и может быть использован повторно. Критическим фактором для Усинга Спеманн микропипетка это иметь некоторый жидкость в пипетку до касания кончиком к поверхности эмбриона. Некоторые из жидкости всегда будет вытекать, когда происходит контакт с мениска над эмбриона. Нажатие на диафрагму позволяет жидкости и трансплантат ткани необходимо извлечь очень точно, в то время как немного ослабевания на диафрагму мягко сосет донорской трансплантата ткани в пипетку. Поддержание немного положительном давлении на мембрану удерживает донорской ткани трансплантата на кончике пипетки при передаче, и немного дополнительное давление на диафрагму позволяет донор трансплантата ткани быть преднамеренно помещен в хосте. Для защиты пипетки Спеманн при хранении и стерилизации, снимите лампу от широкого конца и осторожно вставьте конический наконечник в луковице. Поместите пипетку Спеманн в стеклянную пробирку, прикасайтесь к верхней алюминиевой фольгой, и автоклав до операции. После нескольких пипетки повторноADY, подлежащие стерилизации снова к операции, инвертировать пипетки, нагреть их почти до кипения в том же растворе дистиллированной воды и посуды моющим средством, а затем промойте несколько раз дистиллированной водой. Автоклав пипетки в их отдельных труб. Резиновые трубки, которая образует диафрагму и резиновую грушу следует заменить после нескольких стерилизации или когда они становятся потемнела и жесткой. Многие из компонентов этого протокола привлекать опасное оборудование. Например, порядок принятия Спеманн Микропипетки включает три типа пламени, а также отопление, потянув, дует, гибки и резки, и полировки стекла. Поэтому носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), что повышает безопасность таких как очки и лабораторный халат имеет решающее значение. Кроме того, поскольку многие люди страдают от, или имеют потенциал для развития, аллергии яйцо, всегда использовать перчатки при работе с яйца. С помощью этих мер предосторожности в виду, перепел-утка химерные система яса безопасной, эффективной и относительно доступный метод, который имеет много будущих приложений.

Скелет лица развивается из роста и слияния нескольких процессов лица, которые состоят из нервного гребня и мезодермального мезенхимы окружении эктодермального и энтодермальных эпителиальных слоях 1-11. Морфогенетические события, произошедшие в каждом процессе, регулируются различными взаимодействиями сигнализации между мезенхимы и прилегающих эпителия 12-16. Изменения в этих сигнальных взаимодействий и / или их нижестоящих эффекторов способствовать фенотипов заболевания, а также могут иметь отношение к эволюции черепно-лицевой скелет 17, 18. Поэтому выяснение сроков и характера ткани взаимодействий имеет большой потенциал для увеличения нашего понимания развития и эволюционной биологии лицевого скелета. Использование химерных эмбрионов для исследования тканей взаимодействия имеет долгую историю в биологии развития. Этот подход был впервые Гансом Spemann и его лабораториикоторый обнаружил эмбриональных &quot;организаторы&quot; путем пересадки тканей между эмбрионов разных видов амфибий. Спеманн был мастером микро-хирургических методов, чьи руки навыков были дополнены его развития специализированных инструментов, в частности, пипетки Спеманн. Виктор Гамбургер был аспирантом в лаборатории Ганса Spemann во Фрайбурге в 1920, который является, когда были выполнены оригинальные эксперименты по пересадке, которые привели к Нобелевской премии Шпемана. Когда Гамбургер переехал в Университете Вашингтона в Сент-Луисе в 1935 году, он подробно процесс создания микропипетки Спеманн в его Руководстве по экспериментальной эмбриологии 19. Дрю Noden не был аспирантом в лаборатории Гамбургера Вашингтонского университета до 1972 года. После переезда в Университете Массачусетса, Амхерст, а затем в университете Корнелла, Noden продолжал изготовления и использования Спеманн микропипетки за его хирургические трансплантации, связанных с перепелиным-куриных химер. &amp;# 160;. Несмотря на то, аспирант, один из авторов (Rich Schneider) подготовленных с Дрю Noden в Корнельском с 1995 по 1998 Следующий протокол для принятия микропипетки Спеманн основана на описаниях, написанных Гамбургер и Noden, и включает в себя последующие изменения, внесенные Шнайдер. Использование перепела-куриных химер для изучения черепно-лицевого развития и особенно для понимания вклада клеток нервного гребня был впервые Noden и Ле Douarin в начале 1970-х, отзывы в Ле Douarin др. 20. Этот подход был широко принята во многих исследованиях и многочисленными другими исследователями 1, 4, 5, 21-38. Эквивалентные темпы роста и морфологии перепелов и кур сделать пересадки в них идеально подходит для изучения клеточных судеб и рода трассировки. Тем не менее, из-за сходства между перепелов и кур, морфологические изменения индuced по донорских клеток трудно расшифровать. Напротив, другие птиц химерные системы включили домашней утки, как способ изучения механизмов, которые делают эмбрионы анатомически отличается 39-50. В частности, перепела-утка химерные система предлагает множество преимуществ для взыскательных эффекты донора на хосте, и наоборот. Во-первых, перепелиные и утиные эмбрионы отличаются по размеру тела и формы, что обеспечивает прямой путь для изучения-доноры или размещения с механизмы формирования структур путем анализа для дифференциальных доменов экспрессии генов (рис. 1 А и В). Во-вторых, перепелиные и утиные эмбрионы имеют значительно различные скорости созревания, с перепелиное инкубационное в 17 дней и утка штриховкой на 28 дней. Пересаживают нервного гребня сохраняет свою внутреннюю скорость созревания в принимающей среде, и, таким образом, идентификация временных изменений в экспрессии генов, ткани взаимодействий, гистогенеза и морфогенеза можно51-57. Наконец, анти-перепела ядерное антитело (Q ¢ PN) позволяет доноров и принимающих сотовые взносы, чтобы быть постоянно отличаются друг от друга, признав белок, который экспрессируется повсеместно в перепелиных клетках, но отсутствует от утиных клеток.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>TEK</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s BSS без фенола красного</td><td>Invitrogen</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Нейтральный красный</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4638-5G</td><td>0.22 &; m фильтрованные стерилизованные</td></tr><tr><td>иглы 18 г</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>5 мл шприц</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>No 5 Щипцы Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Прямые ножницы</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Изогнутые ножницы</td><td>Fine Science Tools</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Пипетка</td><td></td> <td>Spemann</td><td>Ручная работа в лаборатории</td></tr><tr><td>Держатель</td><td></td><td></td> для яиц <td>Стеклянная пепельница и пластилина</td></tr><tr><td>Спиртовая горелка</td><td>Fisher</td><td>04-245-1</td><td></td></tr><tr><td>Прозрачная лента</td><td>3M Scotch</td><td>600</td><td></td></tr><tr><td>Стеклянный стержень для перемешивания</td><td>Fisher</td><td>11-380C</td><td>Наконечник сужается и закругляется с помощью пламени</td></tr><tr><td>Вольфстоновая проволока (0,004 x 3 дюйма)</td><td>A-M Systems</td><td>7190</td><td>Наконечник заточен пламенем в пропановой горелке</td></tr><tr><td>Горелка Bunsun</td><td>Горелка Fisher Scientific</td><td>S49117</td><td></td></tr><tr><td>Пипетка Пастера</td><td>Fisherbrand</td><td>22-183-632</td><td>9 дюймов (229 мм)</td></tr><tr><td>Резиновая трубка</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-178C</td><td>янтарь, тонкие стенки натуральный каучук; толщина стенки: 0,0625 дюйма/1,6 мм; Внешний диаметр: 0,375 дюйма/9,5 мм; Внутренний диаметр: 0,25 дюйма/6,4 мм</td></tr><tr><td>Баллон с пропановым топливом</td><td>BernzOmatic</td><td>UL2317</td><td>TX-9 с горелкой типа "А" с навинчивающейся латунью "Карандашное пламя" Горелка</td></tr><tr><td>Diamond Point Pencil</td><td>Fisher</td><td>Scientific 22-268912</td><td></td></tr><tr><td>Резиновые лампы</td><td>Fisherbrand</td><td>S32325</td><td></td></tr></tbody></table>

Оценка Виды-конкретный вклад в черепно-лицевой развития Использование Перепела-утки химер

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Поколение химерных эмбрионов является широко распространенной и мощный подход к изучению клеточных судьбы, ткани взаимодействия и видоспецифичные вклад в гистологических и морфологических развития эмбрионов позвоночных. В частности, использование химерных эмбрионов установил важность нервного гребня в направлении на конкретные виды морфологию черепно-лицевой комплекса. Метод, описанный здесь использует два вида птиц, утки и перепела, с удивительно разной черепно-лицевой морфологии. Этот метод значительно облегчает исследование молекулярной и клеточной регуляции видоспецифичного рисунком в черепно-лицевой комплекса. Эксперименты в перепелиных и утиных химерных эмбрионов уже показал нервного гребня опосредованного тканей взаимодействия и клеточно-автономным поведения, которые регулируют видоспецифических шаблон в черепно-лицевой скелет, мускулатуру и кожного покрова. Большое разнообразие нейронных производных гребня предполагает значительный потенциалдля будущих применений перепела-утки химерных системы к пониманию развития позвоночных, болезни и эволюцию.

До дальнейшего анализа, эффективность трансплантации должна быть проанализирована. Для гистологических, морфологических, или экспрессии генов анализы на образцах тканей, перепелиные клетки должны быть обнаружены с помощью Q ¢ PN антитела, как описано 36 иммуногистохимически. Для РНК анализы, видоспецифические вклад в тканях интерес, могут быть рассчитаны с использованием ПЦР на основе стратегии 58. После эффективность трансплантации была подтверждена, дальнейшие морфологические или молекулярные Критерии оценки может быть оценена в химер. Взаимодействия между донорами клеток нервного гребня и окружающих принимающих полученных тканей, лежащих в основе надлежащего гистогенез и морфогенез черепно-лицевой комплекса ранее изучена. В частности, нервного гребня мезенхимы направляет видоспецифических морфологию лица 7, 13, 51, 59, перо шаблон 52, мышечная шаблон 56 </s<html> до&gt;, и хрящ 53, 57 через регуляции экспрессии генов хозяина. Например, нервный гребень мезенхимы диктует, когда кости формы в нижней челюсти по временно регулирования Bmp4 выражение 55. В последнее время исследования были сосредоточены на ткани взаимодействий, происходящих в самом начале черепно-лицевого развития. В связи с этим эксперименты, использующие перепел-утки химер показали, эмбрионы хост влиять на нейронную миграцию гребень путем определения морфологических границ. То есть, в химерных Quck эмбрионов, донор перепелиные клетки нервного гребня мигрируют в принимающей утка нижней челюсти арка в утку, как шаблон (рис. 1D). Несмотря на это хост вклад в размере нейронной популяции гребня, донор нервный гребень продолжает генерировать нижнечелюстной Скелет, перепел, как по размеру и форме (рис. 1E). е 1 &quot;FO: контент-ширины =&quot; 6 дюймов &quot;FO: Пребывание&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; Перепела-Duck химерический системы Рисунок 1.. (А) Перепела и (Б) утка черепа отображения существенные различия в размере и форме, и, таким образом, идеально подходят для использования химерный систему для изучения черепно-лицевого развития (редактировался Tokia др.. 56). (С) Экспериментальный дизайн для генерации односторонние химерные Quck эмбрионы от стадии соответствием HH9.5 перепела и эмбрионов уток. Нейронной раза удаляется с одной стороны эмбрионов перепела и пересадили в эмбрионы утка после эквивалентной части нервной раза была удалена. (D) Quail донорские клетки (зеленый) может следовать в химер с использованием анти-антитела перепела (Q ¢ PN), как показано на вентральной зрения НН12 химерный эмбрион. (F) В Quck мандибулами в HH38, перепел донор, полученных Meckel7; с хрящ короче и прямее, чем это наблюдается для противоположной утки принимающей полученных хряща Меккелев, которая больше и изогнутые. Печатается Tokita соавт., Дев. Био. 306, 377 (2007) с разрешения Elsevier.

Эта статья описывает способ генерировать химерных эмбрионов, которые предназначены для проверки по конкретным видам вкладов нервного гребня и / или других тканей к черепно-лицевого развития.

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Общая цель данной процедуры заключается в использовании химер перепончатых протоков перепела для изучения механизмов, посредством которых клетки нейрального гребня формируют видоспецифичные паттерны в процессе развития краниофациальных структур. Это достигается путем первоначального препарирования и удаления полоски нейральной складки из средней и передней областей заднего мозга эмбриона перепела на стадии 9.5. Второй этап включает перенос донорской нейральной складки перепела в эмбрион-реципиент утки.Третьим этапом является препарирование и удаление соответствующей области эмбриона утки-хозяина на стадии 9,5. Заключительный этап заключается в перемещении нейральной складки цыпленка в среднюю и переднюю области заднего мозга утки. В конечном итоге полученные химерные эмбрионы позволяют точно определить изменения в экспрессии генов, опосредованные нервным гребнем, с помощью гибридизации in situ, а также выявить морфологические изменения при помощи гистологического анализа.Идея этого метода впервые пришла мне в голову, когда я наблюдал за полетом бурых пеликанов над Оушен-Бич в Сан-Франциско. Я понял, что нейральные гребневые клетки должны быть источником видоспецифичного паттерна, так как именно из них развиваются кости и хрящи скелета их длинного клюва. Хотя мне не удалось разыскать яйца бурых пеликанов, я смог найти яйца белой пекинской утки.Поскольку в Сан-Франциско находится самый большой Чайна-таун за пределами Азии. Используя различия в темпах созревания и морфологии перепелов и уток, этот метод поможет нам ответить на ключевые вопросы биологии развития, такие как понимание происхождения видоспецифических паттернов. Хирургическую операцию будет проводить доктор Дженнифер Фиш, постдокторант моей лаборатории, при содействии Кейт Овиц, аспиранта. Используя горелку Бунзена, нагрейте узкий конец пастевской пипетки до тех пор, пока стекло вдоль конуса не начнет плавиться. Извлеките ее из пламени и потяните за кончик, пока пипетка не будет запечатана.Убедитесь, что внешний диаметр части конуса составляет от 0,7 до одного миллиметра. Затем отломите запаянный конец примерно в четырех сантиметрах от конуса. Далее прикрепите около двух футов резиновой трубки к открытому концу пипетки, зажав ее на другом конце.При осторожном выдувании воздуха через трубку через соединение или другой конец пипетки воздух проходить не должен. Используйте пропановую горелку или пламенную горелку, чтобы нагреть овальную область с одной стороны пипетки чуть ниже начала конуса. Как только стекло начнет выгибаться наружу, уберите пипетку из пламени и осторожно подуйте через резиновую трубку.Это приведет к образованию в нагретой части стекла пузыря сосисообразной формы. Следует избегать чрезмерного давления, так как это может привести к разрыву стеклянного пузыря. Получившееся «окно» в пипетке должно быть примерно одного сантиметра в ширину и от полутора до двух сантиметров в длину.Теперь направьте конический конец вверх и соскребите пузырек в стеклянный контейнер для отходов, осторожно продувая трубку, чтобы предотвратить попадание осколков стекла в пипетку. Затем с помощью пропанового пламени аккуратно обжгите оставшиеся края пузырька и проведите огневую полировку краев открытого окна. Далее, удерживая алмазный карандаш в вертикальном положении, сделайте им надрез на коническом конце пипетки на расстоянии одного сантиметра от начала сужения.С помощью пинцета аккуратно разломите пипетку по надрезу. Чтобы снять наконечник, проверьте под диссекционным микроскопом, является ли разлом ровным и нет ли зазубрин. Держите пипетку так, как держат карандаш, расположив указательный палец над открытым окном примерно в 9.5 миллиметрах от кончика.Размягчите стекло пипетки, удерживая ее рядом с краем пламени спиртовки. С помощью пинцета надавите на кончик, чтобы согнуть узкий конец пипетки под углом 60 градусов под стереомикроскопом. Быстро и осторожно проведите огневую полировку кончика с помощью спиртовки.Готовое отверстие должно быть закругленным и свободным от препятствий. Обратите внимание, что при слишком длительном нахождении в пламени кончик сузится и станет непригодным для использования. Теперь смажьте отрезок резиновой трубки длиной 2.5 сантиметра 70%этанолом.Надвиньте его на ствол пипетки снизу вверх, чтобы закрыть открытое окно. Затем установите латексную грушу объемом 2 мл на открытый конец пипетки. Чтобы поддерживать внутреннее давление воздуха, сначала подготовьте яйцо хозяина.Разрежьте мембрану Витале с помощью заточенной на пламени вольфрамовой иглы и натяните мембрану на эмбрион. Затем снова загерметизируйте яйцо лентой, как это было сделано с донорским яйцом. Снимите ленту с окна донорского яйца, чтобы вырезать нейральную складку из донорского эмбриона.Сделайте надрезы по обеим сторонам нейральной трубки с помощью вольфрамовой иглы с заостренным пламенем концом. Затем сделайте поперечные разрезы нейральной трубки на уровне передней и задней границ трансплантата и аккуратно отделите трансплантат от остальной части нейральной трубки. Обратите внимание на анатомические особенности, такие как различие передней и задней формы трансплантата, что позволит правильно ориентировать донорскую ткань.При введении в реципиент убедитесь, что вольфрамовая игла максимально заострена. Используйте быстрые и уверенные движения, чтобы полностью удалить ткань одним целым фрагментом. Извлеките нейральную складку из эмбриона-донора с помощью пипетки Шамана. Набирайте как можно меньше жидкости, чтобы ткань не всплыла при переносе.Теперь снимите ленту с окна на яйце реципиента и с помощью шамановской пипетки поместите нейральную складку донора рядом с эмбрионом реципиента, примыкающе к области нейральной трубки, в которую будет пересажен трансплантат. Затем отделите нейральную складку от нейральной трубки эмбриона реципиента, как это было сделано с донором. Следите за тем, чтобы размер удаляемого трансплантата был равен размеру ткани донора.Осторожно отодвиньте ткань хозяина подальше от эмбриона. Затем с помощью тупой вольфрамовой иглы или закругленного кончика микропипетки аккуратно переместите донорную нервную складку в нервную трубку хозяина, соблюдая правильную антеропостериорную и дорсовентральную ориентацию. Убедитесь, что трансплантат плотно прилегает по бокам, стараясь не проткнуть и не повредить подлежащие ткани.Стерильный физиологический раствор следует осторожно и аккуратно нанести на эмбрион реципиента. При появлении любых признаков высыхания осторожно запечатайте и промаркируйте яйцо, после чего аккуратно верните его в инкубатор с высокой влажностью, где химерный эмбрион сможет развиться до стадии, необходимой для анализа.Для анализа соберите химерные эмбрионы в свежеприготовленный холодный фиксатор Сары. Затем немедленно поместите их на шейкер-рокер при температуре 4 °C для фиксации в течение ночи. Это обеспечит более чувствительное обнаружение клеток перепела с помощью антител к перепелу.Еще одним важным этапом анализа экспрессии генов с помощью количественной ПЦР в реальном времени является замораживание эмбрионов в жидком азоте перед экстракцией РНК. Улитки и утки демонстрируют значительные различия в размере и форме, поэтому их эмбрионы идеально подходят для создания химерной системы для изучения краниофациального развития.В частности, данная система полезна для исследования роли клеток нервного гребня. При формировании лицевого скелета в химерном эмбрионе перепел-утка донорские клетки нервного гребня перепела мигрируют в нижнечелюстную дугу хозяина-утки. На снимке, сделанном с вентральной стороны, донорские клетки перепела (отмечены зеленым) видны с использованием антител к перепелу, при этом они распределены по паттерну, характерному для утки.В химерном эмбрионе на 12-й стадии развития донорский нейральный гребень формирует мандибулярный скелет, который по размеру и форме соответствует скелету перепела. После освоения техники каждая трансплантация может быть выполнена примерно за пять минут. Если процедура затянется, это подвергнет эмбрион риску десикации, что приведет к снижению показателей выживаемости.При выполнении данной процедуры важно следить за осанкой, расслабить плечи и поддерживать правильное положение кистей рук. Кроме того, рекомендуется выработать определенный порядок действий и каждый раз размещать хирургические инструменты и реагенты в одних и тех же местах, чтобы не отрывать взгляд от микроскопа и перемещать руки автоматически.

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

В этой статье описывается методика трансплантации тканей, который был разработан для тестирования сигнализации и структурирование свойств поверхности головной эктодермы при черепно-лицевой развития.

Оценка сигнализации Свойства эктодермальная эпителия Во время черепно-лицевых развития

Подход к анализу миграции и в конечном итоге судьба птичьего клеток нервного гребня в перепелиных-химерных эмбрионов куриных описано. Этот метод является простым и техника для отслеживания клеток нервного гребня во время миграции и дифференциации, которые иначе трудно различить в unmanipulated куриного эмбриона.

Анализ нейронной миграции Крест и дифференциация по межвидовой трансплантации

Визуализация экспериментальных данных стала ключевым элементом в представлении результатов для научного сообщества. Генерация живой покадровой записи растущих эмбрионов способствует лучшей презентации и понимания сложных процессов развития. Этот протокол является шаг за шагом руководство по маркировке элементов через фотопреобразования Kaede белка у рыбок данио.

Визуализация черепно-лицевого развития в Sox10: Kaede Трансгенные данио рерио Линия Использование Покадровый конфокальной микроскопии

Методика пересадки "Экстремальный Передней домен" лицевой ткани между Xenopus Laevis эмбрионы была разработана. Ткань может быть перемещен из одного гена фоне выражения в другую, что позволяет изучение местных требований к черепно-лицевого развития и для взаимодействия между регионами лица сигнализации.

Трансплантация лица в<em&gt; Xenopus Laevis</em&gt; Эмбрионы

Конфокальной микроскопии Покадровый является мощным средством полезно для характеристики эмбрионального развития. Здесь мы описываем методологию и охарактеризовать черепно-лицевой морфогенез в дикого типа, а также PDGFRA, smad5 и SMO мутантные эмбрионы.

Анализируя черепно-лицевой морфогенеза у рыбок данио Использование 4D конфокальной микроскопии

Метод количественного определения орофациальная размер и форму эмбрионов Xenopus Laevis была разработана. В этом протоколе, традиционные измерения размеров в сочетании с геометрической морфометрии, чтобы обеспечить более сложных анализов орофациального развития и дефектов.

Количественная оценка Орофациальные фенотипов в Xenopus

Сотовый организация черепно костей давно предположили, но никогда непосредственно не визуализируется. Мульти-спектральный мечения клеток и в естественных условиях живут   изображений позволяет визуализировать динамическое поведение клеток в данио нижней челюсти. Здесь мы подробно протокол для управления Zebrabow трансгенных рыб и непосредственно наблюдать клетки интеркаляции и морфологические изменения хондроцитов в хряще в Меккеля.

Визуализация хондроцитов интеркаляции и направленного распространения через Zebrabow клонального анализа клеточной хряща в эмбриональном Меккеля

Эта статья предоставляет метод для изоляции чисто эмбриональных тканей из перепелов и курица эмбрионов, которые могут быть объединены в ex vivo химерных органов.

Изоляция эмбриональных тканей и формирование химерных органов перепела курица с помощью примера тимуса

В этой статье описывается метод трансплантации тканей, который был разработан для проверки сигнальных и паттернирующих свойств базального переднего мозга во время черепно-лицевого развития.

Создание химер переднего мозга птиц для оценки развития лица

В этой статье мы подробно описываем метод, основанный на микрокомпьютерной томографии, для сегментации и измерения 3D-моделей черепно-челюстно-лицевых костей у мышей для лучшей оценки развития черепно-челюстно-лицевых костей у мышей, чем это возможно с помощью современных методов.

Анализ черепно-челюстно-лицевых пороков развития у мышей с помощью трехмерной микрокомпьютерной томографии

Изучите метод создания химерных эмбрионов перепела и утки для исследования роли клеток нервного гребня в черепно-лицевом развитии. Этот подход позволяет выявить видоспецифические механизмы морфогенеза.

Оценка Виды-конкретный вклад в черепно-лицевой развития Использование Перепела-утки химер

Больше видео