Оценка Виды-конкретный вклад в черепно-лицевой развития Использование Перепела-утки химер

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы использовать химеры перепелиных протоков в качестве средства для исследования механизмов, с помощью которых клетки нервной корки генерируют видоспецифичные паттерны во время развития черепно-лицевой формы. Это достигается путем препарирования и удаления полоски нервной складки из средней и передней задней области мозга эмбриона перепела стадии 9,5. Второй этап включает в себя перенос донорской нервной складки перепела в эмбрион утки-хозяина.

Третий этап включает в себя препарирование и удаление эквивалентной области эмбриона утки-хозяина стадии 9,5. Последним шагом является размещение спиральной нервной складки в уткую, среднюю и переднюю область заднего мозга. В конечном счете, полученные химерные эмбрионы могут точно определить опосредованные нейронным гребнем изменения в экспрессии генов посредством гибридизации C-2, а также могут выявить морфологические изменения с помощью гистологических анализов.

Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я наблюдал за тем, как бурые пеликаны летают над Оушен-Бич в Сан-Франциско. Я понял, что клетки нервного гребня должны быть источником видоспецифичного паттерна, поскольку они дают начало костям и хрящам их скелета с длинным клювом. Хотя мне не удалось отыскать коричневые яйца пеликана, мне удалось найти белую утку по-пекински.

Учитывая, что в Сан-Франциско находится самый большой китайский квартал за пределами Азии, используя различия в темпах созревания и морфологии между перепелами и утками. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы биологии развития, такие как понимание происхождения видоспецифичных паттернов, Проводить операцию будет доктор Дженнифер Фиш, постдокторант В моей лаборатории ассистирует Кейт Овиц, аспирантка Используя булочки и горелку, нагрейте узкий конец пипетки для пасты до тех пор, пока стекло вдоль конуса не начнет плавиться. Выньте его из пламени и потяните за наконечник до тех пор, пока пипетка не запечатается.

Убедитесь, что часть конической части имеет внешний диаметр от 0,7 до одного миллиметра. Затем отломайте запаянный конец примерно в четырех сантиметрах от конуса. Затем прикрепите около двух футов резиновой трубки к открытому концу продувки пипетки на другом конце.

Воздух не должен проходить через соединение или другой конец пипетки, обеспечивая при этом мягкое давление путем поддувания трубки. С помощью пропанового карандаша и горелки нагрейте овальную область на одной стороне пипетки чуть ниже начала конуса. Как только стекло начнет прогибаться наружу, снимите пипетку с пламени и осторожно продуйте через резиновую трубку.

Это приведет к тому, что нагретая часть стакана образует пузырь в форме колбасы. Слишком большое давление приведет к тому, что стеклянный пузырь лопнет, и этого следует избегать. Получившееся окошко в пипетке должно быть около одного сантиметра в ширину и полтора-два сантиметра в длину.

Теперь направьте конический конец вверх и соскребите пузырь в стеклянный контейнер для отходов, осторожно продувая трубку, чтобы осколки стекла не попали внутрь пипетки. Затем с помощью пропанового пламени тщательно сожгите оставшиеся края пузыря и отполируйте огнем боковые стороны открытого окна. Затем держите карандаш с алмазным наконечником в вертикальном положении, с помощью карандаша с алмазным наконечником надрежьте конический конец пипетки на расстоянии одного сантиметра от начала конуса.

С помощью щипцов аккуратно разломайте пипетку по надрезанной линии. Чтобы удалить наконечник, проверьте под препарирующим микроскопом, чтобы убедиться, что излом чистый и не зазубренный. Держите пипетку так же, как если бы вы держали карандаш указательным пальцем над открытым окном на расстоянии примерно 9,5 миллиметров от кончика.

Размягчите стекло на пипетке, держа его рядом с краем пламени спиртовой горелки. Надавите на кончик щипцами, чтобы согнуть узкий конец пипетки вниз под углом 60 градусов под зондоскопом для препарирования. Быстро и аккуратно огнем отполируйте наконечник спиртовой горелкой.

Готовое отверстие должно быть закругленным и беспрепятственным. Обратите внимание, что наконечник станет сжатым и непригодным для использования, если держать его в пламени слишком долго. Теперь смажьте резиновую трубку длиной 2,5 сантиметра 70% этанолом.

Наденьте его на стержень пипетки снизу вверх, чтобы закрыть открытое окно. Затем поместите двухмиллилитровую латексную грушу на открытый конец пипетки. Чтобы поддерживать внутреннее давление воздуха, сначала подготовьте яйцо хозяина.

Разрежьте мембрану Vitale с помощью заточенной пламенем вольфрамовой иглы и натяните мембрану на эмбрион. Затем заклейте яйцеклетку скотчем, как это делается для донорской яйцеклетки. Снимите ленту с окна на донорской яйцеклетке, чтобы разрезать нервную складку у донорского эмбриона.

Сделайте прорези с обеих сторон нервной трубки с помощью заточенной пламенем вольфрамовой иглы. Затем разрежьте нервную трубку на желаемом переднем и заднем уровнях трансплантата и дразните трансплантат отдельно от остальной части нервной трубки. Обратите внимание на любые конкретные анатомические детали, такие как передняя и задняя форма трансплантата, которая будет правильно ориентировать донорскую ткань.

При размещении в хосте убедитесь, что вольфрамовая игла очень острая. Используйте быстрые и обдуманные движения для того, чтобы удалить ткань полностью и целиком, удалите нервную складку у донорского эмбриона с помощью шаманской пипетки. Набирайте как можно меньше жидкости, иначе ткань может уплыть при переносе.

Теперь снимите ленту с окна на яйцеклетке-хозяине и с помощью шаманской пипетки поместите донорскую нервную складку рядом с эмбрионом-хозяином, прилегающим к области нервной трубки, которая будет трансплантата. Теперь отделите нервную складку от нервной трубки эмбриона-хозяина, как это сделано с донором. Позаботьтесь об удалении трансплантата того же размера, что и донорская ткань.

Аккуратно отодвиньте эту ткань хозяина подальше от эмбриона. Затем с помощью тупой вольфрамовой иглы или закругленного кончика микропипетки аккуратно переместите донорскую нервную складку в нервную трубку хозяина, сохраняя правильную заднюю и дорсальную вентральную ориентацию. Убедитесь, что трансплантат заправлен по бокам, но не протыкайте и не повреждайте подлежащие ткани.

Стерильный физиологический раствор следует осторожно и аккуратно наносить на эмбрион хозяина. Если есть какие-либо признаки высыхания, теперь тщательно запечатайте и пометьте яйцо и аккуратно верните его в инкубатор с высокой влажностью, где химерный эмбрион может развиться до желаемой стадии. Для анализа.

Для анализа соберите химерные эмбрионы в свежеприготовленный холодный фиксатор Сары. Затем сразу же поставьте их на коромысло при температуре четыре градуса Цельсия для фиксации на ночь. Это позволит более чувствительно обнаруживать перепелиные яйца с антителами против перепелов.

Еще одним важным шагом для анализа экспрессии генов с помощью количественной ПЦР в реальном времени является замораживание эмбрионов и жидкого азота до РНК. Экстракционные катушки и утки демонстрируют значительные различия в размерах и форме, и поэтому их зародыши идеально подходят для создания химерной системы. Изучить черепно-лицевое развитие C.

В частности, система полезна для исследования роли клеток нервного гребня. При формировании лицевого скелета в химерном качестве донора эмбриона нервные клетки нервного гребня перепелов мигрируют в нижнечелюстную дугу утки-хозяина. В виде утки донорские клетки перепелов зеленого цвета просматриваются с помощью антител против перепелов с вентрального вида.

У химерного эмбриона 12 стадии донорский нервный гребень генерирует нижнечелюстной скелет, который по размеру и форме похож на перепелиный. После освоения каждая пересадка может быть выполнена примерно за пять минут. Если все делать правильно, это подвергает эмбрион риску высыхания, и выживаемость снизится.

При выполнении этой процедуры важно следить за своей осанкой, расслаблять плечи и поддерживать правильное положение рук. Кроме того, разработайте распорядок дня и каждый раз размещайте хирургические инструменты и реагенты в одном и том же месте, чтобы вы могли держать глаза в микроскопе и автоматически двигать руками.