Один шаг Очистка Твин-Стрептококковое-меченых белков и их комплексов на Стрептококковое-Tactin Смола, сшитые с бис (сульфосукцинимидил) суберат (BS3)

Здравствуйте, я Кристина МакКеннан из Хельсинкского университета, Финляндия. Одной из основных задач при характеристике конкретного белкового комплекса является определение его молекулярного состава. Это требует разработки методов выделения и очистки комплекса из клеточной среды.

Областью микробиологических исследований являются взаимодействия между растительными вирусами и их хозяевами, в связи с чем нас интересуют различные вирусные рипоновые нуклеопротеиновые комплексы, образующиеся в процессе инфекции. Ранее нам удалось успешно изучить эти комплексы, используя метод очистки на основе аффинной очистки. Тэг Twin-Strep оказался одним из наиболее эффективных тэгов.

Тем не менее мы заметили определенные ограничения при его использовании, одним из которых является низкий выход, поэтому мы решили усовершенствовать этот метод. Здравствуйте, меня зовут Мата, и я ознакомлю вас с экспериментальным протоколом. Но сначала позвольте мне представить общий обзор метода.

Мы используем макро-препаративные бусины со стрептахином для очистки специфических комплексов между белками с двойным стреп-тегом и их физиологическими партнерами по связыванию. Стреп-тетрамер показан зеленым цветом, белок с двойным стреп-тегом — синим, его партнер по связыванию — оранжевым, а две копии стреп-тега — красным.

В каноническом подходе несвязанные белки, обозначенные серым цветом, удаляются путем промывки. Связанные комплексы конкурентно элюируются биотином, показанным розовым цветом. Однако при использовании этого подхода мы наблюдали неполную элюцию связанных комплексов: лишь часть из них успешно отделялась от стрептавидин-гранул.

Это приводит к низкому выходу целевого белка. Осложняя любой дальнейший анализ, выход целевого белка можно повысить, используя денатурирующее элюирование с S-D-S-S-D-S. Вокруг денатурированного белка-приманки с двойным strep-тегом образуются мисс-клетки.

Его партнер по связыванию и диссоциировавшие мономеры стрептактина. Возникающее в результате загрязнение образца высвобожденным стрептактином недопустимо, если образец требует дальнейшего анализа методом масс-спектрометрии. Чтобы решить проблему загрязнения образца, мы разработали метод, при котором тетрамер стрептактина сначала стабилизируется путем химического сшивания.

Полученная сшитая смола используется для очистки белка-приманки и образца элюата его связывающего партнера; элюция с помощью SDS обеспечивает высокий выход белка, в то время как химическая сшивка смолы гарантирует элюцию белка-приманки со Strept-тегом и его связывающего партнера без загрязнения образца высвобожденным Strept. Доведите одну герметичную микроцентрифужную пробирку, содержащую 2 mg сшивающего агента BS3, до комнатной температуры.

Подготовьте наконечник дозатора для переноса смолы, отрезав его конец; повторно суспендируйте смолу Strep-Tactin и Macro-Prep путем кратковременного интенсивного встряхивания, после чего немедленно перенесите 600 µL суспензии в фильтрующий центрифужный столбец CoStar SpinX. Центрифугируйте при 4 000 RPM в течение 30 секунд при комнатной температуре, затем добавьте 450 µL фосфатно-солевого буферного раствора. Целью данного этапа является замена первичного амина трис на нереактивный фосфат.

Слейте профильтрованные остатки. Перемешайте содержимое, несколько раз перевернув пробирку. Повторите этапы центрифугирования и промывки дважды и оставьте смолу в 430 microliters P-B-S-P-H eight.

После последнего центрифугирования проколите фольгу микроцентрифужной пробирки наконечником пипетки, содержащим 100 µL воды Milli-Q. Растворите порошок BS3 в воде, осторожно перемещая жидкость вверх и вниз с помощью пипетки. Как только BS3 полностью растворится, немедленно добавьте 20 µL раствора в колонку SpinX. Убедитесь, что содержимое перемешано должным образом.

Вращайте колонку в течение 30 минут при комнатной температуре, обеспечивая надлежащее перемешивание смолы с раствором BS three. Чтобы остановить реакцию, добавьте шесть µL 3 M Трис, доведенного до pH 7.5 с помощью соляной кислоты. Вращайте колонку еще 15 минут при комнатной температуре, затем центрифугируйте при 4 000 RPM в течение 30 секунд.

При комнатной температуре суспендируйте сшитую смолу в 450 µL трис-буферного салинового раствора с твином 20 и удалите фильтрат. Повторите этапы центрифугирования и промывки еще два раза. На последнем этапе ресуспендируйте смолу в 450 µL TBS. Перенесите суспензию смолы в новую пробирку, ресуспендируйте оставшуюся в колонке смолу еще в 450 µL TBS и перенесите ее в ту же пробирку.

Повторите последний этап еще раз, чтобы обеспечить максимальный перенос смолы из колонки в пробирку. Оставьте пробирку с суспензией смолы на 10 минут при комнатной температуре и доведите объем до 600 µL. После удаления избытка TBS смола готова к немедленному использованию или может храниться при температуре 4 °C без замораживания.

Данный метод подходит для очистки любого слитого белка с двойным strep-тегом и связанных с ним комплексов. Белок может иметь животного, растительного или бактериального происхождения и может быть выделен как из общего клеточного лизата, так и из обогащенной органеллярной фракции. В данном примере мы выделяем белок с двойным strep-тегом VPG Pro вируса Y картофеля из ядерной фракции инфицированных вирусом растений; начните с центрифугирования одного миллилитра образца белка-приманки в буфере для связывания при 13 000 об/мин в течение 10 минут при температуре четырех градусов Цельсия.

Перенесите супернатант в новую пробирку, чтобы минимизировать связывание эндогенных биотинилированных белков со strep tact и смолой. Добавьте avadon до конечной концентрации 100 µg/mL, убедившись, что содержимое тщательно перемешано. Инкубируйте при перемешивании в течение 15 минут при температуре 4 °C.

Ресуспендируйте сшитую смолу с помощью вортекса и, используя наконечник чашеобразной пипетки, немедленно добавьте 50 µL суспензии смолы в пробирку с образцом белка-приманки. Перемешивайте в течение еще 30 минут при температуре 4 °C. Установите термомиксер на 55 °C и предварительно нагрейте 500 µL буфера для элюции (Elu buffer) для использования на этапе элюции; центрифугируйте при 2000 об/мин в течение одной минуты при 4 °C.

Удалите супернатант и промойте смолу одним миллилитром предварительно охлажденного промывочного буфера №1, вращая в течение пяти минут при 4 °C. Повторите этапы центрифугирования и промывки трижды, завершив процедуру на последнем шаге.

Ресуспендируйте смолу в 250 µL промывочного буфера номер два и перенесите суспензию смолы в новую колонку SpinX. Ресуспендируйте оставшуюся в пробирке смолу в еще 250 µL промывочного буфера номер два, перенесите в ту же колонку и центрифугируйте при 2000 RPM в течение трех минут при температуре 4 °C. Перенесите колонку в новую пробирку Dolphin Nose объемом 2 мл и удалите фильтрат.

Немедленно переходите к следующему этапу элюции. Добавьте 150 µL предварительно нагретого буфера для элюции в спин-колонку. Инкубируйте раствор в термомиксе в течение пяти минут при 55 °C, перемешивая при 1400 RPM; центрифугируйте при 4 000 RPM в течение одной минуты при комнатной температуре, после чего удалите колонку.

Очищенные целевые белки теперь готовы к дальнейшему анализу и могут храниться при температуре ниже −20 °C. На изображении видно, что элюция белка из смолы Strept Actin Macro Prep с помощью биотина является неполной по сравнению с элюцией с использованием SDS. Разница в интенсивности сигналов вестерн-блоттинга отражает различный выход белка, полученный при использовании двух методов элюции. Хотя элюция с SDS гораздо эффективнее, чем элюция с биотином, она приводит к загрязнению образца высвобожденным стрептавидином.

На изображении представлен гель с окрашиванием серебром после SDS-элюции с макропрепаративной смолы Strept actin; обратите внимание на наличие высвобожденного strept actin в левой дорожке и его отсутствие в правой дорожке. Образец слева был элюирован из несшитой смолы, а образец справа — из смолы, сшитой с помощью BS three. На основании этих результатов мы делаем вывод, что сшивание с помощью BS three предотвращает высвобождение strept actin из смолы при элюции SDS.

В данном примере мы использовали смолу Strept actin macro prep, сшитую BS3, для очистки белка-приманки VPG PRO и его связывающих партнеров. Аликоту очищенного образца подвергли масс-спектрометрическому анализу для идентификации белков. Отсутствие специфической полосы в отрицательном контроле подтверждает специфичность осаждения.

Нижняя полоса соответствует белку-приманке VPG PRO, а верхняя — его связывающему партнеру NIB replicate, идентифицированному с помощью масс-спектрометрии. Здравствуйте, мы только что продемонстрировали, как химическое сшивание может быть использовано для преодоления ограничений, связанных с денатурацией и элюцией из смолы strep tact. Помимо очистки белково-белковых комплексов, данный метод может быть также применен для очистки белковых комплексов с нуклеиновыми кислотами, включая те, что были подвергнуты обратной сшивке формальдегидом.

Наконец, данный метод может быть использован для очистки мембранных белков с помощью системы Strep-tag. Очистку проводят в присутствии детергентов. Детергенты необходимы для поддержания этих гидрофобных белков в растворимом состоянии.

Однако их присутствие может привести к загрязнению образца высвобожденным стрептавидином. Даже при использовании мягкой элюции биотином, мы полагаем, что сшивка смолы может решить проблему загрязнения образца. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах. Хорошо.