В пробирке агрегации анализов с помощью гиперфосфорилированного тау-белок

Общая цель этой процедуры заключается в мониторинге и сравнении кинетики агрегации немодифицированных и гиперфосфорилированных видов тау-белка. Это достигается путем создания сначала немодифицированного и гиперфосфорилированного тау-белка с помощью каталитической системы, основанной на молниях. Второй шаг заключается в том, чтобы настроить агрегационные анализы таким образом, чтобы они подходили для любого из двух различных инструментов.

Процесс агрегации тау контролируется флуоресценцией двух различных тио. Флавин умирает, флавин S и флавин T. Последним шагом является построение и сравнение кривых агрегации. В конечном счете, кинетические изменения флуоресценции тиофлавина от связывания с агрегированными формами ТА используются для демонстрации гиперфосфорилирования, зависимого от усиления фибрилляции тау in vitro.

Привет.Добро пожаловать в нашу статью JOV. Анализы агрегации in vitro с использованием гиперфосфо-тау-белка. Меня зовут Минко, и эксперименты будут проводиться и демонстрироваться попутно.

И для этого протокола достаточно свежий буфер агрегации сделан в течение последнего месяца. Непосредственно перед его применением добавить ДИО три этола на один миллимоляр также требуется фильтрованный чай Тео Флавин или S стоковый раствор. Стоковый раствор Hein, оба можно хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия, а белок полотенец хранить при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Натяните полотенце на лед, затем отрегулируйте его концентрацию с помощью буфера агрегации по мере необходимости для консистенции. Закрутите полотенце с буфером агрегации и 20, 800 G в течение 10 минут четырех градусов Цельсия. Теперь переложите супинат в другую пробирку и держите его на льду, пока не придет время собрать реакцию агрегации.

Установите агрегационную смесь в микроцентрические пробирки объемом 1,5 миллилитров. Согласно таблице, на одну аликвоту реагентов достаточно 100 микролитров. Рассчитайте общий объем на основе количества реакций и увеличьте его на 10%, чтобы учесть ошибки пипетирования.

Перец в нем может быть заменен на раоновую кислоту или буфер для агрегации, если это необходимо. Перемешайте реакции путем инверсии и перенесите их до 37 градусов Цельсия без вегетации. Каждые 24 часа восполняйте реакции дополнительным одним миллимоляром DTT, чтобы обеспечить восстановительную среду для измерения флуоресценции.

Прогрейте спектрометр флуориметром около 10 минут. Это улучшит согласованность измерений в компьютерном программном обеспечении. Выберите режим отображения в реальном времени, который находится в центре управления приборами.

Установите длину волны возбуждения равной 450 нанометрам со щелью в два нанометра и установите длину волны излучения равной 510 нанометров в щель в пять нанометров. Затем вернитесь в центр управления прибором и выберите анализ постоянной длины волны. Нажмите клавишу Add в верхнем кадре, чтобы добавить набор длин волн.

Установите параметры сбора данных для стандартной ошибки равным единице, а для максимального количества попыток — три. Затем нажмите «Добавить». Далее нажмите «Перейти», чтобы открыть окно отображения данных.

Теперь в окне отображения данных нажмите на кнопку «Начать действие», чтобы открыть диалоговое окно нового образца, и выберите «Неизвестный» для типа образца. Затем приготовьте реакции, чтобы сделать замеры через каждые 100 микролитров по 98. Микролитры агрегационного буфера и два микролитра трех миллимоляров флавина S или T пипеткой перемешайте смесь несколько раз, чтобы обеспечить хорошее перемешивание.

Переложите все 200 микролитров одной смеси в FA three qve и загрузите его на место. Затем облизывайте бег для сбора данных флуоресценции После удаления раствора из ветки трижды промойте его дистиллированной водой и высушите в воздушном потоке. Этот анализ включает флуоресцентный краситель в реакцию aion, что позволяет проводить непрерывные измерения и лучше всего выполнять с помощью автоматического считывателя матовых лунок.

Штатный параметр для работы также ограничен скоростью ручного управления. Установите агрегационную смесь в 96-луночную непрозрачную черную пластину. При 360 микролитре лунки объемом 200 микролитров достаточно для каждой временной точки измерения.

Каждую реакцию хорошо перемешайте с пипеткой. Инкубируйте 96-луночный планшет при температуре 37 градусов Цельсия и каждые 24 часа добавляйте дополнительный один миллимоляр DTT, чтобы обеспечить снижение окружающей среды в каждый момент времени. Для проведения измерения включите многорежимный считыватель микропланшетов и компьютер не менее чем за 10 минут в компьютерном программном обеспечении.

Установите температуру на 37 градусов Цельсия и выберите режим интенсивности флуоресценции. Затем установите длину волны возбуждения на 450 нанометров, а длину волны излучения на пять и 10 нанометров. Вставьте пластину на 96 лунок в вытяжку и нажмите клавишу чтения.

После проведения измерений сразу же верните планшет в инкубатор перед анализом данных, непрерывный режим анализа можно провести с помощью компактного спектрофотометра для этого анализа. Установите агрегационную смесь в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров. 200 микролитров реакций достаточно для измерения временной точки.

Переверните трубки для перемешивания. Настройте реакции при температуре 37 градусов Цельсия или комнатной температуре и добавляйте дополнительный один миллимоляр DTT каждые 24 часа для проведения измерений. Настройте урометр и программное обеспечение так, как это сделано для безкристаллического концевого анализа.

Передайте всю смесь ветеринарному врачу, поместите ее в держатель для образцов в отсеке для образцов и закройте крышку. Нажмите кнопку «Выполнить», чтобы собрать данные флуоресценции через соответствующие интервалы времени. Если этот интервал короткий, например, 30 или 60 секунд, можно оставить ветеринара Q в аппарате между измерениями до тех пор, пока не будет достигнут последний момент времени.

Верните реакцию из веты в пробирку с образцом и верните пробирку в инкубатор по завершении. Наклоняйте вету в соответствии с инструкциями ранее, используя рекомбинантный тау и P tal. Были разработаны два различных протокола для сравнения кинетики агрегации тау и пталя с использованием преимущества сильного флуоресцентного излучения флавина t и s при связывании с агрегатами амилоидных белков, включая тау и птал, с флуоресцентным красителем или без него.

В реакции агрегации наблюдалось последовательное усиление агрегации тау-белка за счет гиперфосфорилирования. Как правило, T и p tal liga быстро растут в течение первых 30 минут перед значительным замедлением, включая флавин. T в реакциях агрегации вызывают значительное замедление скорости агрегации.

И Теоф Флавиан, и он приблизились к плато после реакции в течение 160 минут. Биофлавины, с другой стороны, не вызывали заметного замедления агрегации. После этой процедуры с помощью анализа можно провести дополнительное дополнение центральной нервной системы к изоформам или другим белкам, склонным к агрегации при нейродегенерации, например, с целью понимания вклада протеинизации в патогенез после его развития.

Этот метод приготовления гиперфосфатного верхнего белка PA способ для исследований в полевых условиях, многочисленных заболеваний для изучения наших методов лечения и разработки лекарств.