Наноманипулирование Единого РНК молекул на оптический пинцет

Общая цель следующего эксперимента — продемонстрировать эксперимент по механическому развертыванию одной молекулы на структуре РНК. На первом этапе конструируется проточная камера, которая монтируется на прибор. На втором этапе шарики микронного размера смешиваются с интересующим образцом РНК, а затем два разных размера шариков загружаются в проточную камеру.

Наконец, проточная камера и оптическая ловушка могут быть использованы для направления шариков в контакт друг с другом для оценки различных взаимодействий отдельных молекул. В конечном счете, этот метод наноманипуляций может быть использован для изучения сворачивания РНК на вторичном и третичном структурных уровнях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сворачивания РНК, например, как РНК сворачивается и разворачивается?

Как он перемещается между различными подтверждениями в ответ на изменение окружающей среды? И как он взаимодействует с другими молекулами? Сегодняшний эксперимент будет проведен моим аспирантом, мистером Уильямсом Стивенсоном, чтобы сделать проточную камеру, начните с просверливания шести отверстий диаметром два миллиметра в одном покровном листе номер два.

Затем с помощью лазерного гравера вырежьте три прорези шириной два миллиметра на два куска двусторонней полиамидной ленты. Прикрепите один из кусков ленты к покровному накладке, обязательно совмещая отверстия в ленте с отверстиями в покровном накладке. Прикрепите другой кусок ленты к чистому непросверленному покровному листу.

Снимите защитное покрытие с обоих кусков ленты, а затем поместите стеклянную вытянутую микропипетку и две битрубки между каждым из каналов на одном из защитных стекол. Далее сэндвич, два накрытых стакана, удерживающие микропипетку и байпасные трубки на месте с помощью двух слоев скотча. Чтобы изготовить проточную камеру, установите проточную камеру на заднюю сторону металлической рамы, совпадая с отверстиями в камере над жидкостными каналами.

Затем переверните рамку и подключите каналы к 10-миллилитровым шприцам, заполненным буфером по выбору, через полиэтиленовую трубку. Теперь установите всю камеру на оптический пинцет между двумя объективами, следя за тем, чтобы передняя сторона камеры с жидкостными каналами была обращена вправо. Затем втяните левый объектив и вставьте латунные штифты рамки в монтажные отверстия на пинцете и затяните винты, чтобы зафиксировать патронник на месте.

Используйте эластичный шнур, чтобы поднять инструмент со стола. Поместите прибор в акустический бокс перед подачей шариков в место реакции проточной камеры. Сначала смешайте образец РНК А-колена с анти-D, выкопайте шарики, покрытые кислородным покрытием ENC, или выкопайте шарики, а затем инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 15 минут.

Во время инкубации лотосовую суспензию из сорванного габитуса и покрытых глазом шариков в одномиллилитровый шприц и подсоединить шприц к жидкостной трубке, ведущей к нижнему каналу проточной камеры. Погрузите шприц для загрузки шариков стрептококка в камеру, а затем с помощью программного обеспечения для управления двигателем поместите оптическую ловушку рядом с отверстием нижней байпасной трубки и переместите всю камеру. Затем манипулируйте трековым шариком, чтобы привести в действие оптическую ловушку и захватить стрептококковую бусину.

Используйте программное обеспечение для управления двигателем, чтобы переместить шарик ближе к кончику микропипетки. Затем потяните шприц, подключенный к микропипетке, чтобы вакуумировать шарик на микропипетке, а затем осторожно погрузите шприц, чтобы подать поток в средний канал и смыть оставшиеся шарики стрептококка. Доставьте образец смеси для котлов в верхний канал камеры и захватите бусину, как показано на рисунке.

Затем с помощью оптической ловушки поднесите бусину вплотную к стрептококковой бусине. Нанесите струю для очистки среднего канала. Затем выловить одну молекулу, привязывающуюся между парой бусин.

Поместите захваченную бусину вертикально поверх стрептококковой бусины. Затем поверните ловушку, чтобы переместить валик вниз по направлению к стрептококковому валику, и откройте окно графика расстояния силы на мониторе, чтобы визуализировать изменения силы. Наконец, при контакте переместите штаг вертикально в сторону от стрептококкового валика, отслеживая силу их разделения.

Как только молекула РНК оказывается связанной между бусинами пятью простыми и тремя простыми концами, она может многократно растягиваться и расслабляться. Упругость двухмногочечных ручек обозначается нелинейными кривыми удлинения силы. Кооперативное складывание и разворачивание структуры РНК между ручками отражается резкими разрывами и застежками-молниями на кривой удлинения усилия с отрицательными наклонами, на повторное складывание шпильки указывает молния на кривой удлинения усилия.

Важно отметить, что одна и та же молекула может разворачиваться и сворачиваться каждый раз с разными силами. Такая тенденция проявляется в распределении переходных сил. Механизм обратной связи может быть использован для поддержания постоянной силы на RN. На сворачивание шпильки на РНК указывает укорочение удлинения, в то время как на разворачивание отражается увеличение разгибания: в пассивном режиме положения ловушки и микропипетки фиксированы.

Когда РНК сворачивается в шпильку и укорачивает ее продолжение, захваченная бусина удаляется от центра ловушки, увеличивая силу. Когда РНК удлиняется до одной нити, бусина движется к центру ловушки, уменьшая силу. С помощью этой техники можно наблюдать и манипулировать путями сворачивания РНК.

С пиконьютоновским и нанометровым разрешением время жизни состояний и переходные силы отдельных молекул могут быть накоплены для получения констант скорости и свободной энергии сворачивания РНК. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о терпении при фишинге одной молекулы. Шанс найти одномолекулярный трос между двумя бусинами очень низок.

Поэтому многие пары бусин могут вообще не слипаться.