Step Beyond BRET: флуоресценции по несвязанным возбуждения от люминесценции (ТОПЛИВО)
23 мая 2014 г.
Расширение основу и применимость флуоресценции по несвязанным возбуждения от люминесценции (топлива) по межеванию соответствующие принципы и демонстрирует свою совместимость с множеством флуорофорами и условий антител целевых.
Общая цель следующего эксперимента заключается в том, чтобы продемонстрировать простоту получения топлива и пронаблюдать генерацию красных фотонов вследствие процессов радиационного возбуждения и эмиссии. Это достигается путем объединения биолюминесцентных бактерий и люминесцентных наночастиц для производства топлива. Затем с помощью планшетного ридера биолюминесценции регистрируются полученные красные фотоны; результаты показывают, что значительное количество красных фотонов может быть произведено при совместном содержании биолюминесцентных бактерий и квантовых точек в одном растворе.
Исходя из наблюдаемого увеличения потока красных фотонов, применение данного метода позволяет поставить под сомнение парадигму переноса резидентного входа NCE или Brett, которая часто описывается в литературе. Начиная с отдельных колоний на стандартных культуральных чашках, подготовьте ночные культуры люминесцентных бактерий.
В данной работе штамм Vibrio fischeri использовался в день проведения эксперимента. Поставьте свежие субкультуры и культивируйте их до достижения оптической плотности (OD) при 600 нм от 1 до 1.5. Для получения сопоставимых результатов используйте бактерии в схожих стадиях роста, характеризующихся интенсивным сигналом.
Смешайте аликвоты по 100 µL каждого образца либо с пятью µL флуоресцентного зонда QD 7 0 5, либо с физиологическим раствором. Затем добавьте полученную смесь к 895 µL физиологического раствора в стандартные спектроскопические кюветы. Поместите заполненные кюветы в систему биолюминесцентной визуализации целых животных и проведите измерения с использованием соответствующих наборов фильтров.
Для проведения измерений на различных расстояниях использовался эмиссионный фильтр с диапазоном от 710 до 730 нанометров. Наполните две пластиковые фотометрические кюветы малого объема либо 50 µL QD 705, либо 97,2 µL нефлуоресцентных полистирольных микросфер размером 48 нм в общем объеме 1 mL физиологического раствора. Это обеспечит сопоставимую площадь поверхности твердых частиц на единицу общего объема для обоих образцов.
Подготовьте источник света qve, обернув третью qve стандартной черной изолентой или другим непрозрачным материалом, способным блокировать свет. Осторожно подготовьте два идентичных оптических окна на противоположных сторонах vete. Добавьте аликвоту объемом 1 mL Vibrio fii или другой культуры из свежей субкультуры в vete, служащую источником света, и закройте ее непрозрачным материалом, например черной бумагой, чтобы минимизировать любое воздействие постороннего света.
Затем поместите предварительно заполненные кюветы непосредственно по обе стороны от источника света в имиджере. Визуализируйте три кюветы с квантовыми точками, используя соответствующие эмиссионные фильтры, такие как фильтр общего света и эмиссионные фильтры от 710 до 730 нанометров, при времени экспозиции 10, 30 и 30 секунд соответственно. Получите изображение флуоресценции при возбуждении от 450 до 480 нанометров и эмиссии от 710 до 730 нанометров, чтобы подтвердить положение QD 705.
Переместите оба внешних Q-детектора на равное расстояние дальше от центрального Q-детектора. Затем визуализируйте и получите флуоресцентное изображение, после чего повторите этот процесс до тех пор, пока конечное расстояние между ними не составит три сантиметра. Наполните две кюветы уменьшенного объема: в одну залейте 1 мл раствора, содержащего либо fluoro four, либо интересующую флуоресцентную наночастицу, а в другую — физиологический раствор с нефлуоресцентными наночастицами в качестве отрицательного контроля.
Добавьте аликвоту в 1 mL свежей культуры Vibrio FII или других люминесцентных бактерий в затемненную кювету типа Q, имеющую два физически равных оптических окна, расположенных на противоположных сторонах; закройте окна кюветы непрозрачным материалом, например кусочком черной бумаги, на коротком, но равном расстоянии. Поместите две кюветы с уменьшенным объемом по обе стороны от затемненной Q-кюветы и проведите визуализацию с использованием соответствующих фильтров; в данном случае использовалось расстояние 0,7 cm. Повторите процедуру с другими фракциями QD 705 и бактериями.
Наблюдается значительное увеличение количества красных фотонов по сравнению с образцом, содержащим только бактерии. Контрольный перенос может происходить на больших расстояниях в отсутствие любого абсорбента. Эта зависимость от расстояния может быть охарактеризована законом обратных квадратов.
Для точечных источников. Нацеливание флора-четверок на бактериальную мембрану, по-видимому, оказывает незначительное влияние или не влияет вовсе на общее количество генерируемого сигнала топлива. В данном контексте нацеленное топливо сохраняется даже после нескольких стадий промывки.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как реконструировать топливо в различных режимах для генерации красных фотонов в результате событий излучательного возбуждения.
Обзор
В данном исследовании изучается метод флуоресценции за счет возбуждения несвязанным излучением люминесценции (FUEL), демонстрируя его совместимость с различными флуорофорами и условиями с использованием антител-мишеней. В эксперименте показана генерация красных фотонов в результате взаимодействия биолюминесцентных бактерий и люминесцентных наночастиц.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Методы флуоресценции
- Биолюминесценция
- Взаимодействие наночастиц
Теоретические основы
- FUEL — это новый метод флуоресценции.
- В нем используются биолюминесцентные бактерии для генерации фотонов.
- Совместимость с различными флуорофорами имеет решающее значение для его применения.
- Понимание механизмов генерации фотонов может повлиять на исследования в области флуоресценции.
Цель исследования
- Продемонстрировать простоту метода FUEL.
- Наблюдать за генерацией красных фотонов в результате биолюминесцентных взаимодействий.
- Оценить влияние FUEL на существующие парадигмы флуоресценции.
Используемые методы
- Комбинация биолюминесцентных бактерий и люминесцентных наночастиц.
- Использование планшетного ридера биолюминесценции для измерения потока фотонов.
- Приготовление растворов с различными расстояниями для наблюдения за фотонами.
- Визуализация с использованием специфических эмиссионных фильтров для подтверждения результатов.
Основные результаты
- Наблюдалась значительная генерация красных фотонов.
- Была охарактеризована зависимость генерации фотонов от расстояния.
- Нацеливание флуорофоров на бактериальные мембраны оказало минимальное влияние на сигнал.
- FUEL может эффективно работать на больших расстояниях без использования абсорберов.
Выводы
- FUEL представляет собой перспективный метод для применения флуоресценции.
- Он бросает вызов существующим парадигмам в исследованиях флуоресценции.
- Дальнейшее изучение FUEL может способствовать развитию исследований биолюминесценции.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Метод FUEL расширяет рабочее расстояние возбуждения на основе люминесценции за пределы наноразмерных ограничений BRET, обеспечивая генерацию сигнала в диапазоне от микрометров до сантиметров без использования абсорберов. Эта возможность восполняет критический пространственный пробел в молекулярной визуализации, поддерживая применение в тех случаях, когда традиционные методы переноса энергии оказываются неэффективными. Для биофармацевтических исследований и разработок FUEL предлагает масштабируемый и совместимый с метками подход для изучения биологических взаимодействий в более крупных клеточных или тканевых структурах, что улучшает валидацию мишеней в сложных системах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать молекулярные взаимодействия на расстояниях, недоступных для BRET, что способствует валидации мишеней в условиях низкой плотности или диффузного распределения биомаркеров.
- Операционная ценность: основана на простом смешивании биолюминесцентных источников и флуорофоров, что снижает сложность анализа и обеспечивает совместимость с высокопроизводительным скринингом.
- Прогностическая ценность: обеспечивает количественный считываемый сигнал красных фотонов, который коррелирует с близостью зондов, что помогает в идентификации перспективных соединений-лидеров и снижении механистических рисков.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Совместимость с различными флуорофорами и наночастицами обеспечивает гибкость при разработке анализа для различных классов мишеней.
- Практическая ценность: Генерация сигнала сохраняется после этапов промывки, что обеспечивает воспроизводимое детектирование в гетерогенных образцах.
- Готовность анализа: Работает в стандартном физиологическом растворе без использования специальных буферов, что облегчает интеграцию в существующие платформы для скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает визуализацию всего образца на больших расстояниях, что способствует экстраполяции данных от моделей in vitro к моделям in vivo.
- Сопоставление биомаркеров: использование FUEL с антителами в качестве мишеней позволяет сохранять сигнал после связывания, что дает возможность отслеживать специфическое взаимодействие с мишенью в более широком пространственном масштабе.
- Снижение рисков: зависимость сигнала от расстояния соответствует закону обратных квадратов, что обеспечивает предсказуемую количественную основу для сравнения различных исследований.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Метод FUEL вписывается в континуум этапов исследования: от раннего скрининга взаимодействия с мишенью до доклинической валидации, особенно в тех случаях, когда требуется пространственное разрешение, выходящее за рамки молекулярной близости.
- Биологические исследования: позволяет проверять гипотезы о локализации мишени и образовании комплексов в клеточных средах, где зонды могут не вступать в прямой контакт.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию анализа за счет регулируемого по расстоянию выхода сигнала, что повышает воспроизводимость результатов в разных лабораториях.
- Аналитика: создает количественно измеримый поток красных фотонов, который можно зафиксировать с помощью стандартных приборов для биолюминесцентной визуализации, что позволяет проводить сравнительный анализ условий.
- Трансляционные исследования: связывает события связывания in vitro с детекцией сигнала на уровне тканей, обеспечивая валидацию биомаркеров в доклинических моделях.
- Корпоративное повторное использование: требует только биолюминесцентного источника и флуорофора, что делает данный метод переносимым и недорогим инструментом для использования в нескольких проектах.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Расширяет пространственный диапазон анализов на основе люминесценции, сокращая количество ложноотрицательных результатов при работе с мишенями с низкой концентрацией или диффузным распределением.
- Операционная ценность: Устраняет необходимость в точном молекулярном конъюгировании или непосредственной близости, упрощая подготовку реагентов и снижая вариабельность.
- Стратегическая ценность: Повышает уверенность при принятии решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), позволяя обнаруживать мишени, которые не выявляются методами BRET из-за ограничений по расстоянию.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков, обеспечивая ортогональную валидацию взаимодействия с мишенью в сложных биологических матрицах.
Особенности реализации
- Требуется доступ к культурам биолюминесцентных бактерий или созданным методами генной инженерии люминесцентным системам.
- Зависит от наличия стандартного оборудования для биолюминесцентной визуализации с соответствующими фильтрами для смещенного в красную область излучения (например, 710–730 nm).
- Необходима оптимизация концентрации зонда и интенсивности источника во избежание насыщения сигнала на коротких расстояниях.
- При интерпретации интенсивности сигнала на разных расстояниях необходимо учитывать затухание согласно закону обратных квадратов.
- Ограничено фоновой люминесценцией в автофлуоресцентных или рассеивающих свет образцах, что требует использования надлежащего контроля.
