Выделение моноцитов человека, дважды градиентного центрифугирования и их дифференциации с макрофагами в тефлоновым покрытием культуре клеток Сумки

Общая цель этой процедуры заключается в получении человеческих макрофагов в большом количестве и качестве с помощью стандартного лабораторного оборудования. Это достигается путем центрифугирования крови из пальто Баффи по градиенту FI-вызова для сбора P BMC cs. Далее по градиенту для каждого звонка моноциты отделяются от лимфоцитов.

Затем моноциты высевают в мешки для клеточных культур, покрытых тефлоновым покрытием, и дифференцируют. Через шесть-семь дней макрофаги собирают и высевают для последующих исследований. Полученные клетки должны экспрессировать типичные маркеры зрелых макрофагов и реагировать на различные стимулы, такие как совместное культивирование с опухолевыми клетками или стимуляция с помощью ЛПС. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как противоточный, центрифугирование или магнитно-активированная сортировка клеток, заключается в том, что человеческие макрофаги могут быть сгенерированы с помощью стандартного оборудования для губ без необходимости использования дорогостоящих реагентов или инструментов.

Несмотря на то, что этот метод прост в применении, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности с визуализацией и разделением различных клеточных популяций в градиентах плотности. Поэтому наглядная демонстрация этих шагов поможет преодолеть эти трудности. Этот протокол выполняется в двух экземплярах, чтобы облегчить балансировку роторов.

Начните с дезинфекции двух пакетиков фракции охристой шерсти от слоистой крови. Затем переложите Баффи Пальто в две 50 миллилитровые трубки для каждого Баффи Пальто. Приготовьте три пробирки по 50 миллилитров с 15 миллилитрами раствора комнатной температуры FI call из расчета 1,077 грамма на миллилитр.

Теперь медленно и осторожно нанесите от 30 до 35 миллилитров пухлого слоя на каждую трубку FI call. Слои не следует перемешивать центрифугами эти пробирки, не разламывая при 400 G в течение получаса. При комнатной температуре между двумя фазами образуется белое кольцо мононуклеарных клеток периферической крови.

Удалите эти слои с помощью пластиковой пипетки. Соедините слои трех пробирок от каждого донора в две пробирки по 50 миллилитров на каждого донора. Собранные клетки промыть, добавив один миллимоляр P-B-S-E-D-T-A до 40 миллилитровой линии, а затем центрифугировать их при 300 G в течение 10 минут без разламывания при комнатной температуре.

Теперь аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Затем повторите промывку и P-B-S-C-D-T-A ресуспендируйте и объедините гранулы от каждого донора и 20 миллилитров RPMI плюс FCS без фенола красного. Теперь на одного донора должна приходиться одна пробирка клеток.

Теперь приготовьте вторую градиентную смесь плотности 23,13 миллилитров комнатной температуры на один вызов раствора с 1,87 миллилитров 10 XPBS в 50-миллилитровой пробирке. Приготовьте одну пробирку смеси на каждые два образца. Далее перелейте 23 миллилитра смеси в новую 50-миллилитровую трубку.

Затем добавьте 27 миллилитров RPMI плюс FCS с феноловым красным. В результате получается решение с осмотическим значением ISO 46% на один вызов. Теперь для каждого донора переносят по 25 миллилитров 46%-ного раствора в 50-миллилитровую пробирку и тщательно наслаивают на клеточную смесь.

Две фазы должны быть различимы по цвету без перерыва. Центрифугируйте клетки в течение получаса при комнатной температуре, и при 550 G. Белое кольцо моноцитов будет накапливаться между двумя гранями. Соберите эти клетки в 50-миллилитровую трубку с помощью пластиковой пипетки.

Промойте моноциты одним миллимоляром P-B-S-E-D-T-A, заполненным до отметки 50 миллилитров. Затем центрифугируйте их при 400 G без разбивки в течение 10 минут при комнатной температуре, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулированные моноциты в 20 миллилитрах среды. Затем перейдите к следующему разделу.

В этом протоколе в качестве камеры культивирования используются пакеты для культур с тефлоновым покрытием FEP. Начните с оценки количества собранных моноцитов. Моноциты крупные и часто имеют неправильную форму.

Не стоит считывать более мелкие лимфоциты. Если доступно от 100 до 150 миллионов клеток одного донора, приготовьте 180 миллилитров дополненного РПМИ. Если клеток меньше, приготовьте 30 миллилитров среды на каждые 30-50 миллионов клеток.

В 20 миллилитров аликвоты тщательно смешайте клетки со 180 миллилитрами приготовленной среды. Затем загрузите в пакет с культурами клетки с помощью 50-миллилитрового шприца Perfu, прикрепленного к пробке на пакете для культур. Извлеките шприц, вытолкните оставшийся воздух и закупорьте пробку конусом.

Теперь инкубируйте пакеты в течение шести-семи дней с 5% углекислым газом. После шести-семи дней инкубации перенесите пакеты с культурой в лед, чтобы собрать клетки, полностью погрузите пакеты в лед и дайте им остыть в течение часа-трех часов, чтобы отделить клетки. Далее аккуратно натяните пакеты на край примерно 10 раз.

Затем тщательно продезинфицируйте внешнюю сторону пакетов. Замените конус пробки на шприц объемом 50 миллилитров. Затем вытяните клеточную суспензию и переложите ее в 50-миллилитровую трубку.

Когда все пробирки будут собраны, раскрутите их при 400 G в течение 10 минут При комнатной температуре теперь аспирируйте надосадочную жидкость и объедините все клетки в 10 миллилитров RPMI плюс FCS. Затем посчитайте ячейки, как и раньше. Учитывайте только макрофаги, так как могут присутствовать остаточные лимфоциты.

Затем используйте ячейки для нанесения интересующего вас материала для повторного использования пакетиков с культурой. Дважды промойте их с 70% этанолом. Затем наполните их 50 миллилитрами 70%-ного этанола и выдержите в течение ночи при комнатной температуре на следующий день, трижды промойте пакеты стерильным PBS.

Затем заверните их в стерилизационную бумагу и оставьте в автоклаве. Пакет можно легко использовать повторно с градиентом плотности, в 10 раз превышающим его. Центрифугирование дает белую границу, содержащую лимфоциты и моноциты.

Здесь мы рассмотрим первый градиент плотности. Май Грюнвальд. Окрашивание этих клеток показывает как высокое соотношение цитоплазмы ядра, типичное для лимфоцитов, так и бобовидные или кольцеобразные ядра, типичные для моноцитов.

Эти пятна показывают результаты второго градиента. Каждая охристая оболочка дает около 150 миллионов моноцитов, которые могут быть дифференцированы примерно в 70 миллионов макрофагов. В 20 препаратах 47% моноцитов стали макрофагами.

Очищенные макрофаги могут быть дополнительно обогащены за счет прилипания к пластиковым поверхностям, что не является общим свойством загрязняющих клеток. После нанесения на поверхность большинство макрофагов имеют морфологию жареного яйца, в то время как другие имеют растянутый веретенообразный фенотип. Клетки характеризуются экспрессией нескольких маркеров.

Характерно для зрелых макрофагов. Экспрессия CD 11 B выступает против дендритной дифференцировки, как и отсутствие экспрессии CD 2 0 9. После дифференцировки клетки остаются функционально и метаболически активными в течение пяти-семи дней.

Кальциевое окрашивание жизнеспособных клеток показывает их способность поглощать меченые красными внеклеточными везикулами, выделяемые опухолевыми клетками. Кроме того, макрофаги могут быть активированы, например, стимуляция липополисахаридом приводит к экспрессии нескольких провоспалительных генов. После этой процедуры выделенные макрофаги могут быть подвергнуты огромному спектру функциональных анализов, чтобы ответить на основные вопросы о биологии макрофагов в норме и при заболеваниях.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как генерировать большое количество макрофагов человека. Однако важно помнить, что вы работаете с образцами человеческой крови, которые могут быть потенциально заразными.