Electrospun волокнистых Строительные леса поли (глицерин-dodecanedioate) инженерного нервных тканях От эмбриональных стволовых клеток мыши

Эта процедура заключается в том, что Electros прядет длинные волокна из нового биоразлагаемого полимера под названием полиглицерин Dote Cano eight. Сначала настройте вновь сконструированный коллектор и приготовьте полимерный раствор для электроспиннинга, с помощью шприца и насоса подайте раствор в коллектор. Затем переложите полученный волокнистый мат в чашку для культуры для сшивания.

Далее засейте эмбриональные стволовые клетки мыши на разрезанных волокнах. В конечном счете, результаты могут продемонстрировать, что эмбриональные стволовые клетки мыши могут выживать и дифференцироваться в нервные клетки на волоконных каркасах. В сегодняшнем видео мы показали вам, как подготовить биоматериал из синтез-клеток и, наконец, использовать эти волокна для культивирования клеток.

Особенно, когда мы соединяем с клеткой, полученной из поли и окрашивающей клетки. Они могут иметь очень важное применение в будущем для доставки клеток и создания функциональных тканей. Ткани сегодня не видят, что она продемонстрирует вам ужасную процедуру.

Она — величайшее существо в моей лаборатории. Разрежьте алюминиевую фольгу на прямоугольный кусок. Сложите прямоугольную деталь в прямоугольную полосу и прикрепите ее перпендикулярно плоской металлической пластине с помощью скотча.

Длина полосы зависит от размера волокнистого мата, необходимого для полимерного раствора. Смешайте глицерин и сделайте декан дииевой кислотой в соотношении один к одному моляру при температуре 120 градусов Цельсия в течение 100 часов. Чтобы получить полиглицерин, декановый полимер растворяют полиэтиленоксид и желатин в 65%-ном этаноле с массовым соотношением 1,5 к трем к 95,5 в 15-миллилитровой тубе.

Закрутите крышку и нагревайте смесь в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение часа, помешивая каждые 15 минут, пока базальный раствор не станет однородным. Для электроспиннинга смешайте полимер PGD и базальный раствор. В соотношении четыре к шести весу добавьте в смесь 0,1% рибофлавина и хорошо перемешайте.

Подайте полимерный раствор в стандартный пятимиллилитровый шприц с помощью затупленной иглы из нержавеющей стали 18 калибра. Затем вставьте шприц в шприцевой насос. Прикрепите заземленный провод высоковольтного источника питания к металлической пластине, а положительно заряженный провод — к игле.

Также отрегулируйте расстояние между иглой и алюминиевой фольгой. Полоску до 15 сантиметров. Теперь расположите шприцевой насос под углом около 15 градусов к горизонтали, чтобы предотвратить скопление волокон в передней части полоски.

Включите шприцевой насос и отрегулируйте расход насоса до 0,6 миллилитра в час. Включите высоковольтный источник питания и установите рабочее напряжение на 14,6 киловольт. После завершения сбора подвергните волокнистый коврик воздействию ультрафиолетового света в течение 60 минут для сшивания.

Перенесите волокнистый коврик из полоски алюминиевой фольги в 100-миллиметровую чашку Петри. Разрежьте волокнистый коврик на круглые кусочки одинакового размера с помощью хирургического лезвия и поместите кусочки в 24-луночную пластину. Затем подвергните планшет воздействию ультрафиолетового света в течение еще 20 минут для стерилизации клеток перед обработкой.

Погрузите образцы клетчатки в один миллилитр фосфатного буферного раствора и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи на следующий день. Осторожно отсасывайте PBS. Добавьте по одному миллилитру дифференцировочной среды в каждую лунку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов.

После аспирации среды для дифференцировки осторожно добавьте 0,2 миллилитра геля матри в каждый образец волокна и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Аккуратно удалите излишки геля матри с каждого. Хорошо промойте один раз двумя миллилитрами дифференцировочной среды.

Добавьте один миллилитр тазе в чашку для культуры эмбриональных стволовых клеток мыши через 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Когда клетки MES отделятся, добавьте четыре миллилитра среды для дифференцировки. Соберите плавающие ячейки MES в центрифугу объемом 15 миллилитров при давлении 400 G в течение пяти минут.

Повторно суспендируйте гранулированные клетки в четырех миллилитрах дифференцировки. Терпимая. Перелейте 200 микролитров клеточной суспензии в 15 миллилитровую пробирку и добавьте 10 объемов дифференцировки. Терпимая. Перенесите 15 микролитров разведенной клеточной суспензии в камеру на гемоцитометре.

Установив защитный листок, посчитайте клетки в центральном квадрате в один миллиметр и в четырех угловых квадратах цитометра гемоцитометра. Теперь капля пять раз по 10 к четвертому. Мышиные ЭС-клетки медленно перемещаются на середину образцов волокон.

Добавьте один миллилитр дифференцировочной среды в каждую лунку и культивируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе для прикрепления клеток. Рост и дифференциация. Восполняйте один миллилитр дифференцировочной среды через день.

Чтобы измерить жизнеспособность клеток, отсасывайте старую среду из каждой лунки и добавляйте в культуру один миллилитр разбавления 1 из 10 и флуоресцентного реагента. Среду инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение четырех часов в защищенном от прямых лучей месте. Затем перенесите тройные образцы по 100 микролитров из каждой лунки на 96-луночный планшет и измерьте флуоресценцию, сканирующую электронную микроскопию, изображения использовали для оценки морфологии волокон электросотового прядения.

Диаметры этих волокон, изготовленных с концентрацией 40% ПГД, здесь находятся в микрометровом диапазоне. Дифференцированные эмбриональные стволовые клетки мыши культивировали в течение трех дней на волокнах, а для визуализации сверхэкспрессированного зеленого флуоресцентного белка использовали конфокальную микроскопию. Увеличение количества зеленых флуоресцентных клеток на шестой день указывает на то, что волокнистые каркасы могут поддерживать как клеточную адгезию, так и пролиферацию клеток.

Измерения Zu и флуоресценции показали, что покрытие матригелем и ламинином приводит к эквивалентной жизнеспособности клеток и относительно более высокой пролиферации. Активность флури и маркеры нервных клеток были количественно определены с помощью ПЦР в реальном времени в первый день. Большинство клеток MES, культивируемых на волокнах, экспрессировали маркеры плюрипотентности.

OCT четыре нано, а SOX два. Минорная подгруппа экспрессировала маркеры нейральных стволовых клеток PAC six и neston. После двух недель культивирования наблюдался повышенный уровень экспрессии некоторых маркеров нервных клеток, таких как карта 2 и DCX, а также маркер олигодендроцитов олиго один и маркер астроцитов.

GFAP После освоения. Эту технику можно сделать за два-три часа, если она выполнена правильно.