Профили микроРНК выражение человеческой плюрипотентных клеток, пигментного эпителия сетчатки, полученных из IPS, и плода пигментного эпителия сетчатки

Общая цель данной процедуры заключается в сравнении экспрессии микроРНК в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках, клетках ретинального пигментного эпителия, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, и клетках ретинального пигментного эпителия плода. Для этого сначала проводят культивирование и экспансию ИПСК и РПЭ плода.

Второй этап заключается в дифференцировке ИПСК в РПЭ. Затем из ИПСК, клеток ИПСК-РПЭ и клеток фетального РПЭ экстрагируют РНК. Заключительным этапом является проведение микрочипового анализа микроРНК в образцах РНК и последующий анализ данных.

В конечном итоге анализ путей и сетей используется для идентификации дифференциально экспрессируемых микроРНК, которые задействованы в нескольких клеточных сетях, включая пролиферацию и прогрессию клеточного цикла. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований зрения, такие как роль микроРНК в регуляции дифференцировки в зрелые клетки РПЭ, прогрессии клеточного цикла, пролиферации и старения. Применение этой методики распространяется на терапию с использованием ретинального пигментного эпителия, полученного из стволовых клеток, для замены diseased или поврежденного РПЭ, поскольку можно определить оптимальный номер пассажа клеток, используемых в терапии.

Хотя данный метод позволяет получить представление о факторах, регулирующих дифференцировку RRP из IPS, его также можно применить к другим органным системам, например, для дифференцировки других специфических типов клеток TC из IPS. Чтобы начать выполнение данной процедуры, высейте индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из расчета примерно 350 клеточных колоний на лунку на свежепокрытую планшетную пластину в среде M tester one и дайте колониям IPSL расширяться в культуре в течение четырех-пяти дней.

Затем каждые три дня заменяйте среду M tesser one четырьмя миллилитрами дифференцировочной среды и обновляйте половину объема среды свежей дифференцировочной средой. Дайте пигментированным фокусам вырасти до размеров, позволяющих выделить их из культуры вручную, что занимает примерно 40–50 дней. После этого с помощью наконечника пипетки на 200 µL аккуратно вырежьте и поднимите пигментированные колонии.

Соберите и объедините выделенные колонии в конической пробирке объемом 15 миллилитров. Добавьте пять миллилитров среды DMMF 12 к объединенным клеткам РПЭ и центрифугируйте при 300 GS в течение пяти минут. Затем удалите среду, ресуспендируйте осадок клеток в пяти миллилитрах среды и повторите центрифугирование.

Удалите среду из осадка клеток. Затем приготовьте суспензию одиночных клеток, инкубируя объединенные I-P-S-R-P-E с 0,25% TRIPSIN EDTA в течение пяти-десяти минут при 37 °C до диссоциации клеточных агрегатов на одиночные клетки. Промойте клетки I-P-S-R-P-E средой I-P-S-R-P-E, а затем высейте собранные клетки на свежую планшетную среду, покрытую Matrigel, в четырех миллилитрах культуральной среды I-P-S-R-P-E; культивируйте клетки в течение трех недель перед пассированием и заменяйте среду на свежую среду I-P-S-R-P-E каждые три дня в ходе эксперимента.

Высейте клетки I-P-S-R-P-E с плотностью 100, 000 клеток на квадратный сантиметр, затем соберите недифференцированные IPS-клетки через 17 дней после посева. Культивируйте клетки до тех пор, пока недифференцированные колонии не станут плотными в центре. При достижении этого состояния промойте колонии средой D-M-E-M-F 12, после чего диссоциируйте IPS-клетки до состояния единичных клеток с помощью Accutane.

Соберите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 300 Gs в течение пяти минут. Отсосипите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в двух миллилитрах среды D-M-E-M-F 12. Для сбора фетального РПЭ сначала промойте культуры клеток фетального РПЭ средой D-M-E-M-F 12. Затем диссоциируйте культуры до состояния одиночных клеток, используя 0.25% TRIPSIN EDTA в течение пяти-десяти минут при 37 °C.

Соберите клетки плодового РПЭ в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 300 g в течение пяти минут. Затем аспирируйте супернатант и ресуспендируйте осадок клеток в 2 мл среды D-M-E-M-F 12.

Соберите клетки I-P-S-R-P-E на 17-й день. После третьего и пятого пассажа дважды промойте клетки I-P-S-R-P-E в PBS и приготовьте суспензию одиночных клеток, инкубируя их с одним миллилитром 0,25% трипсина от 5 до 10 минут при 37 °C. Затем нейтрализуйте трипсин двумя миллилитрами ледяной среды для I-P-S-R-P-E и соберите клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Центрифугируйте пробирку в течение пяти минут при 300 G, затем аспирируйте супернатант. Ресуспендируйте осадок клеток в трех миллилитрах окрашивающего буфера из набора с микросферами; центрифугируйте суспензию клеток I-P-S-R-P-E в окрашивающем буфере при 300 G в течение пяти минут. Затем аспирируйте супернатант и ресуспендируйте.

Ресуспендируйте осадок клеток в окрашивающем буфере из набора микросфер до концентрации 2 × 10⁶ клеток на 100 µL. Добавьте 10 µL антитела anti-TRA1-60 PE на каждые 2 × 10⁶ клеток. Тщательно перемешайте и инкубируйте при температуре 4 °C в течение 10 минут.

Промойте клетки в 1 мл окрашивающего буфера на 2×10⁶ клеток. Затем центрифугируйте клеточную суспензию в течение 10 минут при 300 ×g. После этого аспирируйте супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 80 µL окрашивающего буфера на 2×10⁶ клеток.

Затем добавьте 20 µL микросфер, меченных анти-PE, на 2 × 10⁶ клеток. Тщательно перемешайте и инкубируйте в течение 15 минут при 4 °C. Добавьте 1 mL буфера для окрашивания на 2 × 10⁶ клеток, центрифугируйте в течение 10 минут при 300 ×g и аспирируйте супернатант.

Затем ресуспендируйте осадок клеток в 500 µL окрашивающего буфера и выделите TRA1-60-отрицательные клетки с помощью магнитного сепаратора клеток, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Лизируйте клетки, пропустив каждый образец через имеющуюся в продаже микроцентрифужную гомогенизирующую мини-спин-колонку, предназначенную для мини-препарирования нуклеиновых кислот. Затем экстрагируйте общую РНК из ИПСК, iRPE и фетальных RPE с помощью имеющегося в продаже набора для экстракции РНК, предназначенного для сохранения малых молекул РНК.

Используйте спектрофотометр NanoDrop для определения общей концентрации РНК; создайте файл Excel со списком микроРНК, уровни экспрессии которых различались как минимум в два раза между группами образцов. Затем войдите в онлайн-программу анализа путей РНК и загрузите файл Excel. В качестве формата файла выберите flexible format, а в выпадающем списке идентификаторов выберите Agilent.

Введите данные в разделе «raw data» (исходные данные). Назначьте идентификатор (ID) столбцу «probe ID», а значение «observation one» и логарифмическое отношение — столбцу «log ratio». Для всех остальных столбцов выберите «ignore» (игнорировать).

Выберите параметры анализа следующим образом: в поле доверия (confidence) выберите только «experimentally observed», включите прямые и косвенные связи (direct and indirect relationships), а также эндогенные химические вещества (endogenous chemicals). В качестве эталонного набора выберите базу знаний Ingenuity Knowledge Base. Затем выберите базу данных эталонных молекул.

Сюда входят данные по всем видам, всем клеточным линиям и тканям, а также всем мутациям. После выбора всех параметров запустите сетевой анализ, выбрав раздел сетей. Затем выберите перекрывающиеся сети и нажмите на интересующую вас сеть, чтобы просмотреть результаты.

ИКСП-клетки, дифференцированные в I-P-S-R-P-E клетки, проявили классический фенотип РПЭ с гексагональной морфологией пигментированных клеток, что сходно с клетками РПЭ плода. Сравнение профиля экспрессии микроРНК недифференцированных ИКСП-клеток с I-P-S-R-P-E клетками выявило повышение экспрессии 47 микроРНК и снижение экспрессии 36 микроРНК, в то время как в клетках РПЭ плода по сравнению с I-P-S-R-P-E клетками экспрессия была повышена для 61 микроРНК и снижена для 49. Анализ путей с помощью программного обеспечения Ingenuity IPA показал, что гены-мишени дифференциально экспрессируемых микроРНК участвуют в таких клеточных процессах, как развитие клеток, рост и клеточный цикл. Этот анализ также показал, что микроРНК, экспрессируемые в тканях глаза in vivo, были обогащены в I-P-S-R-P-E и клетках РПЭ плода по сравнению с ИКСП-клетками. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости предотвращения контаминации и деградации образцов РНК после завершения процедуры.

Для подтверждения уровня экспрессии микроРНК в каждом типе клеток после их развертывания могут быть использованы другие методы, такие как ОТ-ПЦР. Данная методика открыла исследователям в области офтальмологии путь к изучению роли микроРНК в дифференцировке и прогрессировании клеточного цикла в RPE. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как получать RPE из IPS-клеток и как сравнивать профиль экспрессии микроРНК в IPS-RPE с профилями в IPS-клетках и фетальном RPE.