4.10: Генотипирование мышей

Генотипирование — это процесс обнаружения наличия или отсутствия определенных последовательностей ДНК в геноме конкретного организма.

Поскольку гены могут влиять на фенотип мыши, возможность исследовать генетический состав отдельной мыши, или «генотип», имеет решающее значение для отнесения фенотипа к конкретному гену. В этом видео будет рассмотрена генетика мышей, продемонстрированы ключевые этапы процедуры генотипирования и объяснено, как интерпретировать результаты генотипирования на основе ПЦР.

Чтобы понять, на что обращают внимание исследователи при генотипировании мышей, давайте рассмотрим некоторые распространенные манипуляции с генетикой мышей.

Чтобы изучить ген, ученые часто нарушают его функцию, изменяя его генетическую последовательность. Однако мыши являются диплоидными, поэтому у них есть две копии любого данного гена. Поскольку большинству генов для функционирования требуется только одна нормальная копия, мыши должны быть выведены для получения животного с разрушенными обоими генами до изучения фенотипа.

Этот генотип называется «гомозиготным нокаутом». Или, чаще всего, просто «нокаут»? Для краткости. И наоборот, нормальная мышь с двумя функциональными копиями называется «гомозиготным диким типом». или просто «дикий тип.? Наконец, мыши, имеющие только одну функциональную копию, называются «гетерозиготными». или «hets.»?

Вместо удаления генетического материала некоторые эксперименты требуют введения последовательностей ДНК в геном мыши. Эти вставленные фрагменты ДНК называются «трансгенами». А мыши, которые их переносят, являются «трансгенными». Самый распространенный «трансген? введен мышам тот, который стимулирует экспрессию зеленого флуоресцентного белка, или GFP, из медуз. Используя тканеспецифический промотор (регуляторную последовательность, которая «стимулирует» активность гена) для управления производством GFP, клетки определенного типа тканей могут быть легко идентифицированы с помощью зеленой флуоресценции.

Поскольку многие генетические изменения не приводят к легко наблюдаемому фенотипу, такому как экспрессия GFP, мышей необходимо генотипировать, чтобы определить, какое конкретно животное следует использовать в экспериментах. Перед генотипированием мыши должны быть тщательно помечены, чтобы их можно было идентифицировать позже. Нет, вам понадобится что-то более постоянное. Одним из распространенных методов является создание насечек в ухе таким образом, чтобы положение и количество насечек соответствовали идентификационному номеру.

После того, как мышь помечена, соберите небольшой кусочек ткани (обычно 2-5 мм хвоста, с помощью бритвенного лезвия или ножниц), из которого извлеките ДНК. Если вы собираете ткань у нескольких мышей, отметьте используемые сегменты лезвия, чтобы убедиться, что вы не будете использовать одну и ту же часть на следующем животном, что может привести к перекрестному загрязнению ваших образцов.

Чтобы начать процесс отделения генетического материала от других компонентов ткани, образец расщепляют в буфере для лизиса, содержащем фермент протеиназу К. После ночного разложения образец центрифугируется для гранулирования волос и любого другого непереваренного материала. Чтобы выделить ДНК из переваренного лизата, простым и эффективным методом является добавление алкоголя в осадок нуклеиновых кислот. После короткой инкубации образец снова центрифугируют для сбора ДНК в грануле.

После промывки 70% этанолом для удаления избытка солей, гранула ДНК ресуспендируется в воде или буфере и готова к генотипированию.

Существует множество стратегий для определения того, присутствует ли конкретная последовательность ДНК у ваших мышей. Большинство из них требуют сначала амплификации интересующей генетической области с помощью полимеразной цепной реакции, или ПЦР. Для получения дополнительной информации о том, как настроить ПЦР, ознакомьтесь с JoVE Science Education ? Руководство по ПЦР.

Одним из методов различения генотипов является обнаружение изменений в размере фрагмента, амплифицированного с помощью ПЦР. Допустим, вы проводите скрининг мышей с генетической вставкой 700 пар оснований. После ПЦР полосы дикого типа составляют 200 пар оснований, а трансгенные полосы должны состоять из 900 пар оснований.

После проведения ПЦР разделите продукты реакции на соответствующем процентном содержании агарозного геля, чтобы вы могли различить размеры ваших фрагментов. Элемент управления wildtype должен иметь только полосу wildtype из 200 пар оснований; трансгенный контроль должен иметь только одну пару оснований 900, трансгенную полосу; И блок управления HET должен иметь обе полосы. Наконец, "нет шаблона? Контроль включен для того, чтобы убедиться, что реагенты не содержат загрязняющей ДНК и, следовательно, не должны образовывать полосы.

Теперь, когда мы уверены, что управление сработало как ожидалось, давайте посмотрим на неизвестных мышей. Поскольку мыши 1 и 2 имеют только одну полосу дикого типа, они являются гомозиготными дикими типами. Мыши 4 и 6 имеют только одну трансгенную полосу и поэтому являются гомозиготными трансгенами.

А мыши 3 и 5 имеют по две полосы, и поэтому являются гетами.

Наконец, когда вы вернетесь, чтобы найти мышей с нужным вам генотипом, вам просто нужно сопоставить узор ушных выемок с идентификационным номером мыши.

После того, как вы разберетесь в том, что такое генотипирование и как оно проводится, давайте рассмотрим несколько примеров того, почему это полезно.

В некоторых случаях для получения желаемого фенотипа требуются более сложные генетические модификации. Например, чтобы установить эту модель рака кожи у мышей, требуется два трансгена. Один из них несет индуцируемый «онкоген», или ген, который может вызвать рак, а второй несет фермент Cre рекомбиназу, который экспрессируется только в клетках кожи и удаляет последовательность, предотвращающую транскрипцию онкогенов, тем самым обеспечивая экспрессию онкогенов. Чтобы получить потомство с обоими трансгенами, гетерозиготных по каждому из них мышей скрещивают. Затем генотипирование используется для идентификации желаемого потомства.

Иногда бывает невозможно генотипировать мышей до проведения эксперимента. Например, в этом исследовании частоты сердечных сокращений у эмбрионов невозможно собрать ткань для генотипирования эмбрионов без нарушения их поведения. Поэтому сначала тщательно маркируются положения эмбрионов в организме матери, а затем регистрируются ультразвуковые измерения. Наконец, берется биопсия хвоста для определения влияния генотипа на частоту сердечных сокращений.

В этом видео был продемонстрирован один из методов экстракции ДНК, но существует множество вариаций. Например, система Direct PCR требует менее пяти минут для переваривания тканей. Кроме того, после вращения непереваренного материала надосадочная жидкость готова к ПЦР, что устраняет необходимость в очистке ДНК.

Вы только что посмотрели руководство JoVE по генотипированию мышей. В этом видео мы рассмотрели основы генетики мышей, способы подготовки и анализа образцов ДНК мышей, а также некоторые практические применения этой методики. Спасибо за просмотр!