Генотипирование мышей

Генотипирование — это процесс определения наличия или отсутствия специфических последовательностей ДНК в геноме конкретного организма.

Поскольку гены могут влиять на фенотип мыши, возможность анализа генетического состава или «генотипа» отдельной особи имеет решающее значение для соотнесения фенотипа с конкретным геном. В данном видео рассматриваются основы генетики мышей, демонстрируются ключевые этапы процедуры генотипирования и объясняется интерпретация результатов генотипирования методом ПЦР.

Чтобы понять, на что обращают внимание исследователи при генотипировании мышей, давайте рассмотрим некоторые распространенные манипуляции с генетикой мышей.

Для изучения гена ученые часто нарушают его функцию, изменяя его генетическую последовательность. Однако мыши диплоидны, поэтому они имеют две копии любого данного гена. Поскольку большинству генов для функционирования достаточно одной нормальной копии, для изучения фенотипа необходимо разводить мышей так, чтобы получить животное с нарушением в обеих копиях гена.

Такой генотип называется «гомозиготным нокаутом» или, чаще, просто «нокаутом». И наоборот, нормальная мышь с двумя функциональными копиями называется «гомозиготным диким типом» или просто «диким типом». Наконец, мышей с одной функциональной копией называют «гетерозиготными» или «гетами».

Вместо удаления генетического материала некоторые эксперименты требуют введения последовательностей ДНК в геном мыши. Эти вставленные фрагменты ДНК называются «трансгенами», а мыши, которые их несут, — «трансгенными». Наиболее распространенным «трансгеном», вводимым мышам, является ген, обеспечивающий экспрессию зеленого флуоресцентного белка (GFP) из медузы. Используя тканеспецифический промотор (регуляторную последовательность, которая «стимулирует» активность гена) для запуска продукции GFP, можно легко идентифицировать клетки определенного типа ткани по зеленой флуоресценции.

Поскольку многие генетические изменения не приводят к легко наблюдаемому фенотипу, такому как экспрессия GFP, мышам необходимо проводить генотипирование, чтобы определить, какое именно животное следует использовать в экспериментах. Перед генотипированием мыши должны быть тщательно промаркированы, чтобы их можно было идентифицировать позже. Для этого потребуется более постоянный метод маркировки. Один из распространенных способов — нанесение зазубин на ушную раковину, при этом положение и количество зазубин соответствуют идентификационному номеру.

После маркировки мыши возьмите небольшой фрагмент ткани (обычно 2 — 5 mm хвоста, используя лезвие бритвы или ножницы) для последующей экстракции ДНК. Если вы собираете ткани от нескольких мышей, помечайте использованные сегменты лезвия, чтобы гарантировать, что вы не будете использовать ту же часть для следующего животного, так как это может привести к перекрестному загрязнению ваших образцов.

Для начала процесса отделения генетического материала от других компонентов ткани образец подвергают перевариванию в лизирующем буфере, содержащем фермент протеиназа K. После переваривания в течение ночи образец центрифугируют, чтобы осадить волоски и любой другой непереваренный материал. Простым и эффективным методом выделения ДНК из переваренного лизата является добавление спирта для осаждения нуклеиновых кислот. После короткой инкубации образец снова центрифугируют для сбора ДНК в виде осадка.

После промывки 70% этанолом для удаления избытка солей осадок ДНК ресуспендируют в воде или буфере, после чего он готов к генотипированию.

Существует множество стратегий для определения наличия определенной последовательности ДНК у ваших мышей. Большинство из них требуют предварительного амплифицирования интересующего генетического региона с помощью полимеразной цепной реакции, или ПЦР. Для получения дополнительной информации о постановке ПЦР, пожалуйста, ознакомьтесь с руководством JoVE Science Education «Guide to PCR».

Одним из методов различения генотипов является обнаружение изменений в размере амплифицированного в ходе ПЦР фрагмента. Допустим, вы проводите скрининг мышей на наличие генетической вставки размером 700 пар оснований. После ПЦР полосы дикого типа будут иметь размер 200 пар оснований, а полосы трансгена должны быть размером 900 пар оснований.

После проведения ПЦР разделите продукты реакции на агарозном геле соответствующей концентрации, чтобы вы могли различить размеры ваших фрагментов. В контроле дикого типа должна присутствовать только полоса дикого типа размером 200 пар оснований; в трансгенном контроле должна быть только одна полоса трансгена размером 900 пар оснований; а в гетерозиготном контроле должны присутствовать обе полосы. Наконец, включается контроль «без матрицы», чтобы убедиться, что реагенты не содержат контаминирующей ДНК, и, следовательно, в нем не должно появиться никаких полос.

Теперь, когда мы убедились, что контроли сработали ожидаемым образом, давайте изучим неизвестных мышей. Поскольку у мышей 1 и 2 имеется только одна полоса дикого типа, они являются гомозиготами по дикому типу. У мышей 4 и 6 имеется только одна полоса трансгена, следовательно, они являются гомозиготными трансгенными мышами.

А у мышей 3 и 5 наблюдаются две полосы, следовательно, они являются гетерозиготами.

Наконец, чтобы найти мышей с нужным вам генотипом, вам достаточно сопоставить схему меток на ушах с идентификационным номером мыши.

Теперь, когда мы разобрались в том, что такое генотипирование и как оно проводится, рассмотрим несколько примеров того, почему оно полезно.

В некоторых случаях для получения желаемого фенотипа требуются более сложные генетические модификации. Например, для создания данной модели рака кожи у мышей необходимы два трансгена. Один из них содержит индуцибельный «онкоген» — ген, способный вызвать развитие рака, а второй содержит фермент Cre-рекомбиназу, которая экспрессируется только в клетках кожи и вырезает последовательность, препятствующую транскрипции онкогена, тем самым обеспечивая его экспрессию. Чтобы получить потомство с обоими трансгенами, скрещивают мышей, гетерозиготных по каждому из них. Затем с помощью генотипирования определяют подходящее потомство.

Иногда генотипирование мышей перед экспериментом может быть невозможным. Например, при данном исследовании частоты сердечных сокращений эмбрионов невозможно отобрать ткань для генотипирования у эмбрионов, не нарушив их жизнедеятельность. Поэтому сначала тщательно маркируют положение эмбрионов в организме матери, затем проводят измерения с помощью ультразвука. В завершение делают биопсию хвоста для определения влияния генотипа на частоту сердечных сокращений.

В данном видео был продемонстрирован один из методов экстракции ДНК, однако существует множество вариаций. Например, система Direct PCR требует менее пяти минут переваривания ткани. Кроме того, после центрифугирования непереваренного материала супернатант готов к ПЦР, что исключает необходимость очистки ДНК.

Вы только что посмотрели руководство JoVE по генотипированию мышей. В этом видео мы рассмотрели основы генетики мышей, способы подготовки и анализа образцов ДНК мышей, а также некоторые практические применения этого метода. Спасибо за просмотр!