Добыча Venom и Venom железы Microdissections от пауков для протеомные и транскриптомных анализов

Общая цель этой процедуры заключается в извлечении яда и препарировании ядовитых желез у пауков для транскриптомных и протеомных исследований, что достигается путем предварительной подготовки оборудования и реагентов, необходимых для сбора яда с помощью электрической стимуляции. Второй шаг – обездвиживание обезболенного паука щипцами под препарирующим микроскопом. Далее паук получает импульс током и выделяющийся яд собирается с помощью микрокапиллярной трубки.

Заключительным этапом является вскрытие ядовитых желез паука через два-три дня. В конечном счете, масс-спектрометрия или другие протеомные анализы яда используются для отображения последовательностей составляющих белков яда. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы сбора яда трудно изучить, потому что они включают в себя последовательность скоординированных действий, которые должны быть выполнены быстро, но осторожно.

Для начала подключите шнур питания электростимулятора к розетке и присоедините внешнюю ножную педаль к внешнему сигнальному входу. Затем убедитесь, что переключатель полярности находится в нормальном режиме, и подключите положительный электрод к красной выходной клемме электростимулятора, а отрицательный электрод подключите к черной выходной клемме. Затем установите стимулятор на следующие рекомендуемые начальные настройки.

Проверьте выход электрода, прикрепив зажимы типа «крокодил» к контрольным проводам измерителя положительного и отрицательного напряжения. Затем включите выключатель питания стимулятора и подайте ток с помощью ножной педали. Подготовьте легкие щипцы, покрыв один зубец жидким пластиком, и подождите четыре часа, пока покрытие высохнет после того, как пластик высохнет, плотно оберните 15 миллиметров противоположного кончика зубца AP одним слоем хлопчатобумажной швейной нити и закрепите нить, завязав конец узлом.

Далее, используя острые ножницы, отрежьте кончик тупой иглы для подкожных инъекций, достаточно маленькой, чтобы не навредить пауку, и в то же время достаточно большой, чтобы избежать засорения. Разгладьте отверстие наждачной бумагой и прикрепите иглу к вакуумной ловушке для отходов. Затем расположите легкие щипцы горизонтально в плотно закрытом положении с помощью двузубого зажима с виниловым покрытием, прикрепленного к магнитному основанию под полем зрения препарирующего микроскопа с пластиковым покрытием сверху и резьбовым покрытием снизу.

Затем прикрепите зажим из кожи аллигатора с положительным электродом к нижнему зубцу перед нитью и прикрепите зажим из кожи аллигатора с отрицательным электродом к тупой металлической вакуумной игле. Затем поместите положительный провод на зубец щипцов между нитью и зажимом типа «крокодил», а отрицательный — на тупую вакуумную иглу. Чтобы проверить ток в цепи вольтметра, нажмите ножную педаль, чтобы убедиться, что обнаружен достаточный ток, и снимите провода, надев защитные очки.

Подготовьте несколько микрокапиллярных трубок для сбора яда. Затем поместите монтажную шпаклевку в чашку Петри и положите микрокапилляры на полоску. Рукой в перчатке возьмите одну микрокапиллярную трубку на одном конце, а другой конец стерильными металлическими щипцами держите над пламенем горелки Бунзена и оттяните конец от пламени, чтобы создать удлиненный кончик, удерживая другой конец в неподвижном положении, осмотрите концы микрокапилляров под препарирующим микроскопом и создайте небольшое скошенное отверстие на вытянутом конце с помощью стерилизованных металлических щипцов.

Закройте трубки и положите их на лед. Чтобы начать обездвиживание паука, включите газ в камере СО2. Затем перенесите паука с помощью длинных металлических щипцов из закрытой пластиковой сборной пробирки в камеру СО2.

Подержите паука в камере от пяти до 10 минут и убедитесь, что паук больше не движется мимо. Аккуратно протыкаем его длинными щипцами. Затем с помощью переводной пипетки с физиологическим раствором намочите нить на щипцах.

Затем извлеките обезболиваемого паука из камеры CO2, подняв его за передние ноги. С помощью тупых рассекающих щипцов и рук в перчатках переместите обезболенного паука к аппарату с легкими щипцами. Затем отделите зубцы закрытых легких щипцов и поместите между зубцами головную мышцу паука.

Дайте зубцам закрыться, чтобы убедиться, что паук плотно удерживается на месте, но не раздавливается Быстро убедитесь, что паук расположен корпусом тыльной стороной вниз, опираясь на зубец с резьбовым покрытием, и подфюзеляжная сторона автомобиля обращена к пластиковому покрытию, в то время как положительный электрод остается прикрепленным к нижнему зубцу. Далее отрегулируйте увеличение препарирующего микроскопа, фокус и источник света до тех пор, пока не станут отчетливо видны паучьи клыки. Чтобы начать сбор яда, включите пылесос и опрыскайте угольную шахту с пауками водой.

С помощью второго шприца с тупым концом иглы отсосите воду вакуумной иглой, чтобы удалить загрязнения. Далее прикоснитесь иглой вакуума отрицательным электродом к роструму паука и подайте импульс ножной педалью. Лапки паука будут сжиматься, и яд будет виден в виде прозрачных капель, выходящих из клыков.

При необходимости пропылесосьте и срыгните. Затем соберите капли яда с помощью микрокапиллярного наконечника и перенесите капиллярный кончик в 0,5 миллилитровую трубку с водой, которая будет засасываться в капилляр. Избегайте прокола паука капилляром и загрязнения капилляра шелком и клеем из колючек.

Затем прикрепите шприц для переноса с адаптером для трубки к микрокапилляру на конце, противоположном наконечнику для сбора, и выдайте раствор яда обратно в трубку и поместите трубку на пробирки, содержащие яд для льда, при температуре минус 80 градусов Цельсия. Когда закончите, когда закончите сбор яда, поднесите к пауку открытый пластиковый флакон для сбора яда вместе с крышкой. Для быстрого переноса осторожно обхватите ноги паука тупыми рассекающими щипцами, которые держат в одной руке, и осторожно раскройте легкие щипцы другой рукой.

Затем поместите паука в собирательный флакон с помощью тупых щипцов. И быстро закрыть колпачок через два-три дня после сбора яда, обезболить паука в камере с СО2, затем заполнить носитель жидким азотом и поместить его рядом с препарирующим микроскопом. Очистите область рассечения и щипцы с помощью РНК.

Затем наполните маленькую чашку Петри одним x цитратом солевого раствора натрия и поместите ее под препарирующий микроскоп. Далее перенесите паука из камеры СО2 в чашку Петри и с помощью щипцов быстро отделите головную грудь от брюшка. Затем проведите головную мышцу под препарирующим микроскопом с помощью щипцов и поместите угольную шахту в поле зрения.

С помощью острых концов второй пары щипцов разрежьте кутикулу, соединяющую карабазу с боковыми частями угольной шахты латерально. Возьмитесь за угольную шахту второй парой щипцов и осторожно тяните вперед и назад, пока ядовитые железы не будут вытянуты. Занимает не более 15 минут.

Отделите железы от угольной шахты и перенесите их в криобезопасную пробирку объемом 0,5 миллилитра. Поместите закрытую пробирку в жидкий азот, объединив методы масс-спектрометрии с базами данных последовательностей, созданными из ядовой железы CD NA. Библиотеки позволили идентифицировать белки яда. Нелепый пептид Laro был одним из 36 белков, идентифицированных из яда черной вдовы с помощью масс-спектрометрии.

Не забывайте, что работа с пауками, такими как черные вдовы, может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение защитных перчаток.