Добыча Venom и Venom железы Microdissections от пауков для протеомные и транскриптомных анализов

Общая цель данной процедуры заключается в экстракции яда и препарировании ядовитых желез пауков для транскриптомных и протеомных исследований; это достигается путем предварительной подготовки оборудования и реагентов, необходимых для сбора яда методом электрической стимуляции. На втором этапе паука иммобилизуют и анестезируют с помощью пинцета под диссекционным микроскопом. Затем пауку подают электрические импульсы, а выделившийся яд собирают с помощью микрокапиллярной трубки.

Заключительным этапом является препарирование ядовитых желез паука через два-три дня. В конечном итоге для определения последовательностей составляющих яд белков используется масс-спектрометрия или другие методы протеомного анализа яда. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы сбора яда трудно освоить, поскольку они требуют последовательности скоординированных действий, которые необходимо выполнять быстро, но осторожно.

Для начала подключите шнур питания электростимулятора к розетке и подсоедините внешнюю ножную педаль к внешнему входу сигнала. Затем убедитесь, что переключатель полярности находится в нормальном режиме, и подключите положительный электрод к красному выходному терминалу электростимулятора, а отрицательный электрод — к черному выходному терминалу. После этого установите на стимуляторе следующие рекомендуемые начальные параметры.

Проверьте выход электрода, подсоединив зажимы типа «крокодил» к положительному и отрицательному щупам вольтметра. Затем включите выключатель питания стимулятора и подайте ток с помощью ножной педали. Подготовьте сверхлегкий пинцет, покрыв один бранш жидким пластиком, и подождите четыре часа до полного высыхания покрытия. После высыхания пластика плотно обмотайте 15 мм кончика противоположного бранша пинцета одним слоем хлопковой швейной нити и закрепите нить, завязав конец узлом.

Затем с помощью острых ножниц срежьте кончик тупоконечной гиподермической иглы так, чтобы отверстие было достаточно малым, чтобы не повредить паука, но достаточно большим, чтобы избежать засорения. Зашлифуйте края отверстия наждачной бумагой и присоедините иглу к вакуумной ловушке для отходов. После этого установите сверхлегкий пинцет в горизонтальном плотно закрытом положении с помощью двухзубчатого зажима с виниловым покрытием, закрепленного на магнитном основании в поле зрения диссекционного микроскопа, при этом зубец с пластиковым покрытием должен быть сверху, а зубец с нитяным покрытием — снизу.

Затем прикрепите зажим «крокодил» положительного электрода к нижнему зубцу выше нити, а зажим «крокодил» отрицательного электрода — к тупоконечной металлической вакуумной игле. После этого поместите положительный щуп на зубец пинцета между нитью и зажимом «крокодил», а отрицательный щуп — на тупоконечную вакуумную иглу. Чтобы проверить ток в цепи вольтметра, нажмите на педаль, чтобы убедиться в обнаружении достаточного тока, затем снимите щупы, используя защитные очки.

Подготовьте несколько микрокапилляров для сбора яда. Затем поместите полоску монтажного пластилина в чашку Петри и разложите на ней микрокапилляры. Одной рукой в перчатке удерживайте один конец микрокапилляра, а другой конец зажмите стерильным металлическим пинцетом над пламенем горелки Бунзена; потяните конец трубки в сторону от пламени, чтобы сформировать вытянутый кончик, удерживая другой конец неподвижно. Осмотрите концы микрокапилляров под диссекционным микроскопом и с помощью стерильного металлического пинцета создайте небольшое скошенное отверстие на вытянутом конце.

Закройте пробирки и поместите их на лед. Чтобы начать иммобилизацию паука, включите подачу газа в камеру с CO2. Затем с помощью длинного металлического пинцета перенесите паука из закрытого пластикового флакона для сбора в камеру с CO2.

Оставьте паука в камере на 5–10 минут и убедитесь, что он больше не двигается, осторожно прикоснувшись к нему длинным пинцетом. Затем с помощью переносной пипетки с физиологическим раствором смочите кончик пинцета.

Затем извлеките анестезированного паука из камеры с CO2, захватив его за передние ноги. С помощью тупых анатомических пинцетов и в перчатках перенесите анестезированного паука в устройство с сверхлегким пинцетом. После этого разведите бранши закрытого сверхлегкого пинцета и поместите головогрудь паука между ними.

Сведите зубцы, чтобы паук был плотно зафиксирован, но не раздавлен. Быстро убедитесь, что паук расположен спинной стороной карапакса вниз, опираясь на покрытый нитью зубец, в то время как брюшная сторона обращена к пластиковому покрытию, а положительный электрод остается прикрепленным к нижнему зубцу. Затем отрегулируйте увеличение, фокус диссекционного микроскопа и источник света до тех пор, пока хелицеры и клыки паука не станут четко видны. Чтобы начать сбор яда, включите вакуумный насос и опрыскайте область хелицер паука водой.

Используя вторую иглу шприца с тупым концом, отсосите воду с помощью вакуумной иглы для удаления примесей. Затем прикоснитесь вакуумной иглой с отрицательным электродом к роструму паука и подайте импульс с помощью ножной педали. Ноги паука сократятся, и яд станет виден в виде прозрачных капель, выделяющихся из хелицер.

При необходимости удалите регургитат с помощью вакуума. Затем соберите капли яда микрокапиллярным наконечником и перенесите его в пробирку объемом 0,5 milliliter с водой, которая всосется в капилляр. Избегайте прокалывания паука капилляром, а также загрязнения капилляра паутиной и клеем с фиксаторов.

Затем прикрепите шприц для переноса с трубчатым адаптером к микрокапилляру с противоположной от собирающего наконечника стороны, введите раствор яда обратно в пробирку и поместите пробирку на лед; храните пробирки с ядом при температуре -80 °C. По завершении сбора яда поставьте открытый пластиковый флакон для сбора вместе с крышкой рядом с пауком. Для быстрого переноса аккуратно захватите лапки паука тупыми диссекционными пинцетами, удерживая их в одной руке, и осторожно раскройте сверхлегкие пинцеты другой рукой.

Затем с помощью тупых пинцетов перенесите паука в пробирку для сбора. Быстро закройте крышку. Через два-три дня после сбора яда подвергните паука анестезии в камере с CO2, затем наполните контейнер с жидким азотом и поместите его рядом с диссекционным микроскопом. Очистите область препарирования и пинцеты с помощью средства RNA away.

Затем наполните небольшую чашку Петри 1х раствором цитрата натрия и поместите ее под стереомикроскоп. Далее перенесите паука из камеры с CO2 в чашку Петри и с помощью пинцета быстро отделите головогрудь от брюшка. Затем зафиксируйте головогрудь пинцетом под стереомикроскопом и поместите хелицеру в поле зрения.

Используйте острые концы второго пинцета, чтобы отсечь кутикулу, соединяющую карабазу с латеральными сторонами коллиерии латерально. Захватите коллиерию вторым пинцетом и осторожно потяните ее вперед и назад, пока ядовитые железы не будут извлечены. Процедура должна занимать не более 15 минут.

Отделите железы от коллатералей и перенесите их в криопробирку объемом 0.5 milliliter. Поместите закрытую пробирку в жидкий азот. Интеграция методов масс-спектрометрии с базами данных последовательностей, созданными на основе библиотек кДНК ядовитых желез, позволила идентифицировать белки яда. Laro inept peptide стал одним из 36 белков, идентифицированных в яде черной вдовы с помощью масс-спектрометрии.

Не забывайте, что работа с такими пауками, как черные вдовы, может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование защитных перчаток.