Протон Передача и конформации белка Динамика в светочувствительных белков с временным разрешением Шаг сканирования ИК-Фурье спектроскопии

Общая цель данной процедуры заключается в изучении динамики протонирования и конформационных изменений двух фоточувствительных мембранных белков с помощью ИК-фурье-спектроскопии с временным разрешением в режиме пошагового сканирования (STEP scan FTIR spectroscopy). Для этого сначала создают гидратированный белковый слой, инфракрасное поглощение которого исследуется либо в конфигурации нарушенного полного внутреннего отражения для бактериородопсина, либо в конфигурации пропускания для канала Rhodopsin 2. На втором этапе образец возбуждают наносекундной лазерной вспышкой соответствующей длины волны для инициирования фотоциклической реакции в белке, регистрируя изменения интенсивности инфракрасного излучения, взаимодействующего с образцом, с временным разрешением.

Затем вышеописанный процесс повторяют в дискретных положениях подвижного зеркала интерферометра, которое контролирует разность оптического хода между двумя разделившимися пучками, до полной записи интерферограммы с временным разрешением. Заключительным этапом является преобразование интерферограммы с временным разрешением в ИК-спектры разностного поглощения с временным разрешением с использованием преобразования Фурье и закона Ламберта-Бера. В конечном итоге анализируется временная эволюция полос, особенно в области MI и в области двойных связей C=O карбоксильных групп, для изучения динамики конформационных изменений и процессов протонирования белка.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с большинством существующих экспериментальных методов является то, что она позволяет фиксировать транзиторные изменения протонирования белков. Более того, это происходит в микро- и миллисекундных временных масштабах, которые являются наиболее актуальным диапазоном для изучения функциональности белков. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области молекулярной биофизики и науки о белках, например, какие именно остатки протонируются и в какой момент это происходит в ходе функционального механизма белка, а также когда в белках происходят основные изменения.

Демонстрацию процедуры проведет Виктор Риа, научный сотрудник моей лаборатории. Сначала установите приставку нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) в отделение для образцов ИК-фурье-спектрометра. Измерьте широкий энергетический спектр с разрешением 4 см⁻¹ для чистой поверхности элемента внутреннего отражения с помощью стандартной ИК-фурье-спектроскопии в режиме быстрого сканирования. Покройте поверхность НПВО 20 µL буфера с высокой ионной силой, который будет использоваться позже для регидратации образца.

Затем измерьте ИК-поглощение буфера. После этого удалите буфер и промойте поверхность водой, не касаясь её. Удалите остатки жидкости интенсивным потоком воздуха, затем нанесите на поверхность примерно 3 µL раствора белка бактерии Rodin в пурпурной мембране с концентрацией 6 mg/mL.

Высушите суспензию белка под слабой струей сухого воздуха до образования пленки. Затем измерьте спектр поглощения сухой пленки. После этого осторожно добавьте от 20 до 40 µL буфера с высокой ионной силой для регидратации сухой пленки.

Накройте держатель A TR крышкой, чтобы предотвратить испарение воды при измерении спектра поглощения. Оцените процент образца, оставшегося у поверхности после регидратации пленки, вычтя спектр поглощения буфера. На этом этапе добавьте 10 µL channel opsin two, растворенного в decalside в буфере с низкой ионной силой, в центр окна из фторида бария диаметром 20 mm.

Распределите раствор с помощью наконечника микропипетки до диаметра 6–8 мм, используя слабый поток сухого воздуха, для получения однородной сухой пленки, диаметр которой примерно соответствует размеру ИК-луча при максимальной апертуре. Затем используйте плоское силиконовое уплотнительное кольцо толщиной 1 мм. Гидратируйте пленку, добавив 3–5 µL смеси глицерина и воды, распределив ее в виде 3–5 капель вокруг сухой пленки, и плотно закройте конструкцию вторым окном.

Поместите окна из фторида бария в держатель. Затем установите держатель в отделение для образца. Измерьте спектр поглощения.

Подтвердите, что максимальное поглощение в области амида I для установки A TR находится в диапазоне от 0,6 до 1,0. Для ввода лазерного излучения в образец используйте оптическое волокно, размещенное на крышке A TR. Отрегулируйте плотность энергии лазера на образце до 2–3 мДж/см² за импульс.

Используя измеритель мощности или проводя эксперименты по пропусканию, с помощью зеркал направьте лазер на образец и, при необходимости, используйте линзы, чтобы сфокусировать или отклонить лазерный луч, доведя его диаметр до значения, немного превышающего размер пленки образца. Синхронизируйте лазерный импульс с записью данных, используя Q-переключатель. Используйте выходной TTL-импульс синхронизации электроники неодимового лазера на алюмо-иттриевом гранате для запуска аналого-цифрового преобразователя спектрометра.

Установите скорость возбуждения лазера для проведения измерений с временным разрешением. Выполните пошаговое сканирование в спектральном диапазоне от 1800 до 850 см⁻¹. Поместите в оптический путь низкочастотный оптический фильтр, который является непрозрачным выше 1 950 см⁻¹ и обладает хорошим пропусканием ниже 1800 см⁻¹.

Затем переключите детектор из режима переменного тока (AC) в режим постоянного тока (DC). На этом этапе установите уровень постоянного тока ИНТЕРФЕРОГРАММЫ на ноль, приложив к детектору ток смещения. Повторно настройте электронное усиление, чтобы более эффективно использовать динамический диапазон аналого-цифрового преобразователя.

После этого запустите меню пошагового сканирования ИК-Фурье-спектрометра. Установите целевую спектральную полосу пропускания для измерения методом пошагового сканирования, равную одной восьмой волнового числа гелий-неонового лазера. Установите спектральное и фазовое разрешение на уровне 8 см⁻¹ и 64 см⁻¹ соответственно.

Выберите функцию аппертуры. Затем установите режим сбора данных ИНТЕРФЕРОГРАММЫ на «single side forward». Установите частоту дискретизации аналого-цифрового преобразователя на максимально доступную в спектрометре.

Установите внешний триггер для эксперимента. Затем задайте количество линейно распределенных точек данных для записи, включая 100 точек до срабатывания триггера. Далее установите число повторений или количество усреднений фотореакции для каждого положения зеркала и запустите эксперимент.

Наконец, повторите эксперимент 10 раз для бактериального редзина и 35 раз на трех различных образцах пленок для красного канала редзина, чтобы получить примерно 200 совмещений на одну характеристическую полосу в положении зеркала; в спектре поглощения сухого пенообразного слоя бактериального редзина отчетливо видны полосы колебаний амидных групп пептидных связей. При использовании буферов с низкой ионной силой пленка чрезмерно расширяется, что снижает количество белка, зондируемого эванесцентным полем. Точная зависимость между набуханием пленки и ионной силой буфера будет зависеть, помимо прочего, от природы липидов.

Набухание пленки после гидратации требует времени для достижения стабилизации бактерий dosin. В пурпурной мембране этот процесс является моноэкспоненциальным с постоянной времени 12 минут. 3D-график типичного эксперимента FDIR с временным разрешением и пошаговым сканированием на бактериях.

Здесь представлен Redsin. Спектры могут быть получены в определенные моменты времени. Например, когда ожидается достижение максимальной популяции промежуточных состояний в фотоцикле redsin бактерий.

На временных траекториях изменений абсорбции в бактериальном родопсине при 1 762 см⁻¹ представлены данные о динамике протонирования-депротонирования аспартата 85, а при 1 741 см⁻¹ — о изменениях водородных связей и динамике депротонирования-репротонирования аспарагиновой кислоты 96. Временные траектории при 1 670 и 1 555 см⁻¹.

Отчет об изменениях колебаний MI одного и двух типов, которые чувствительны к конформации пептидного остова. После применения данного метода могут быть использованы другие подходы, такие как сайт-направленный нейрогенез или ретинальная ферментная спектроскопия, чтобы сопоставить колебательные полосы с конкретными остатками в белке после его разработки. Эта методика открыла исследователям в области молекулярной биофизики путь к изучению функциональных механизмов множества различных светочувствительных белков.