Протон Передача и конформации белка Динамика в светочувствительных белков с временным разрешением Шаг сканирования ИК-Фурье спектроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании динамики протонирования и подтверждающих изменений двух фоточувствительных мембранных белков с помощью STEP сканирования с временным разрешением, ИК-Фурье спектроскопии. Это достигается путем формирования гидратированной белковой пленки, инфракрасное поглощение которой будет зондироваться либо в конфигурации ослабленного полного отражения для опсина бактерий, либо в конфигурации пропускания для канала Rodin 2. Второй шаг заключается в возбуждении образца наносекундной лазерной вспышкой подходящей длины волны, чтобы инициировать фотоциклическую реакцию в обнаружении белка во времени, разрешенных изменениями интенсивности инфракрасного света, взаимодействующего с образцом.

Затем описанный выше процесс повторяется в дискретных положениях подвижного зеркала интерферометра, который контролирует разность оптических путей между двумя разделенными лучами до тех пор, пока не будет записана интерферограмма с полным временным разрешением. Последним шагом является преобразование интерферограммы с временным разрешением в инфракрасные разностные спектры поглощения с временным разрешением с использованием преобразования Фурье и пивного закона Ламберта. В конечном счете, исследуется временная эволюция банов, особенно в ИМ и в карбоновых областях с двойной связью CO, чтобы получить динамику подтверждающих и протонных изменений в белке.

Основным преимуществом методики большинства существующих экспериментальных методов является то, что она разрешает транзиторные протонные изменения в белках. Более того, он делает это на микро- и миллисекундном временных масштабах, наиболее релевантном временном диапазоне для исследования функциональности белка. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области молекулярной биофизики и науки о белках, например, какие остатки протоната и когда они образуются во время функционального механизма белка или когда происходят серьезные изменения в белках.

Демонстрация процедуры будет выполнена научным сотрудником Виктором Риа из моей лаборатории First mount, ослабленным полным отражением или аксессуаром TR в отсеке для образцов ИК-Фурье спектрометра. Измерьте широкий диапазон энергетических спектров с точностью до четырех обратных сантиметров. Разрешение чистой поверхности внутреннего отражающего элемента с помощью обычного быстрого сканирования ИК-Фурье спектроскопии покрывает поверхность A TR 20 микролитрами буфера с высокой ионной силой, используемого позже для регидратации образца.

Затем измерьте поглощение ИК-излучения буфером. Далее снимите буфер и промойте поверхность водой, не касаясь ее. Удалите остатки жидкости интенсивным потоком воздуха, распределите примерно три микролитра шести миллиграммов на миллилитр белкового раствора бактерии Родена в фиолетовой мембране поверх поверхности.

Высушите белковую суспензию под слабой струей сухого воздуха до образования пленки. Затем измерьте спектр поглощения сухой пленки. После этого аккуратно добавьте от 20 до 40 микролитров буфера с высокой ионной силой, чтобы регидратировать сухую пленку.

Накройте держатель A TR крышкой, чтобы предотвратить испарение воды и спектр абсорбента. Оцените процент образца, остающегося у поверхности после регидратации пленки, путем вычитания спектра поглощения буфера. На этом этапе добавьте 10 микролитров опсина канала, растворенного в дек, в буфере с низкой ионной силой в центре окна из фторида бария диаметром 20 миллиметров.

Распределите раствор с помощью наконечника микропипетки на диаметр шесть-восемь миллиметров с помощью слабого потока сухого воздуха, теплой однородной пленки, диаметр которой примерно соответствует размеру ИК-луча на самой большой апертуре. Далее используйте плоское силиконовое уплотнительное кольцо толщиной в один миллиметр. Увлажните пленку, добавив от трех до пяти микролитров смеси глицерина и воды, распределенной по три-пять капель вокруг сухой пленки, и плотно закройте ее вторым окном.

Вставьте сэндвич-окна из фторида бария в держатель. Затем поместите держатель в отсек для образцов. Измерьте спектр поглощения.

Убедитесь, что максимальное поглощение в области амида находится в диапазоне от 0,6 до 1,0 для установки A TR. Используйте оптическое волокно, размещенное в верхней части крышки A TR, чтобы соединить лазер с образцом. Отрегулируйте плотность энергии лазера на образце с точностью до двух-трех миллиджоулей на квадратный сантиметр в импульсе.

Используя измеритель мощности или эксперименты с просвечиванием, используйте зеркала, чтобы подвести лазер к образцу, и, если это необходимо, линзы, чтобы либо сопоставить, либо отклонить лазерный луч до диаметра, немного превышающего размер пленки образца. Синхронизируйте лазерный импульс с записью данных с помощью модуля добротности. Синхронизируйте импульс TTL электроники неодимового лазера с атриевым атриевым атриевым гранатом для запуска спектрометра аналого-цифрового преобразователя.

Установите частоту возбуждения лазера для выполнения с временным разрешением. Измерения с помощью ступенчатого сканирования в спектральном диапазоне от 1800 до 850 обратных сантиметров. Поместите оптический фильтр нижних частот в оптический путь, который непрозрачен на расстоянии выше 1 950 обратных сантиметров и имеет хорошее пропускание ниже 1800 обратных сантиметров.

Затем переключите детектор с переменного тока на режим связи по постоянному току. На этом этапе доведите постоянный ток интерферограммы до нуля, подав на детектор смещение тока. Отрегулируйте электронное усиление для более эффективного использования динамического диапазона аналого-цифрового преобразователя.

После этого запустите меню ступенчатого сканирования ИК-Фурье спектрометра. Установите целевую спектральную полосу пропускания для измерения с помощью ступенчатого сканирования равной одной восьмой волнового числа гелий-неонового лазера. Установите спектральное и фазовое разрешение на восемь обратных сантиметров и 64 обратных сантиметра соответственно.

Выберите функцию appe. Затем установите режим сбора данных ИНТЕРФЕРОГРАММА в положение «Одна сторона вперед». Установите частоту дискретизации аналого-цифрового преобразователя на максимальную доступную для спектрометра.

Установите триггер для эксперимента в положение Внешний. Затем задайте количество линейно расположенных точек данных для записи, включая 100 триггерных точек pret. Затем установите количество совместных изданий или количество средних значений фотореакции на положение зеркала и начните эксперимент.

Наконец, повторите эксперимент 10 раз для бактерий, редсина, и 35 раз на трех разных образцах пленки для канала редсин два, чтобы получить примерно 200 соприсоединений на положение зеркала. При использовании буферов с низкой ионной силой пленка чрезмерно расширяется, уменьшая количество белка, зондируемого затухающим полем. Точная зависимость между набуханием пленки и ионной силой буфера будет зависеть, среди прочих факторов, от природы липидов.

Набухание пленки после гидратации требует времени для стабилизации бактерий дозина. В фиолетовой мембране процесс моноэкспоненциальный с постоянной времени 12 минут. 3D-график из типичного ступенчатого сканирования с временным разрешением, эксперимент FDIR на бактериях.

Здесь показан Редсин. Спектры могут быть извлечены в определенное время. Например, когда ожидается, что промежуточные состояния в фотоцикле бактерий достигнут наибольшей популяции.

В бактериальном стержне Доссина время цикла отслеживания поглощения изменяется на 1,762 инверсных сантиметра. Сообщает о динамике депротонирования аспартата 85 и при 1 741 обратном сантиметре об изменениях водородных связей и динамике репродукции депротонирования аспарагиновой кислоты.96. Отсчет времени составляет 1,670 и 1,555 инверсных сантиметров.

Сообщайте об изменениях в ИМ 1 и 2 вибрациях, которые чувствительны к подтверждению пептидной основы. Следуя этому методу, могут быть выполнены другие методы, такие как сайт-направленный нейрогенез или спектроскопия фермента сетчатки, чтобы назначить вибрационную полосу специфическим остаткам в белке после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в области молекулярной биофизики к изучению функционального механизма множества различных белков, управляемых светом.