Методы для характеристики Спонтанное и Впечатлите вызванной Locomotion в Ротенон вызванной болезнью Паркинсона модели

Общая цель следующего эксперимента заключается в определении вызванной испугом и долгосрочной спонтанной локомоции на модели болезни Паркинсона у drosophila, индуцированной ротеноном; это достигается путем выращивания drosophila на корме с добавлением ротенона для индукции фенотипа. На втором этапе мухи подвергаются анализу реакции испуга с использованием аппарата с двумя флаконами и анализу долгосрочной спонтанной локомоции. Результаты, полученные с помощью монитора активности drosophila, показывают, что воздействие ротенона вызывает дефекты локомоции у drosophila, что подтверждается количественной оценкой реакции испуга и долгосрочной спонтанной локомоции.

Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения дрозофил, моделей нейродегенеративных расстройств и нарушений локомоции, таких как дефекты локомоции, вызванной испугом, и долгосрочной спонтанной локомоции. Для начала добавьте 1,5 grams мгновенной среды для дрозофил. В стандартном флаконе для мух приготовьте среду, добавив пять milliliters деионизированной воды, содержащей соответствующую дозу ротенона.

Затем седитируют от 8 до 12 самцов мух в возрасте от одного до трех дней с помощью углекислого газа и переносят их в пробирки с препаратом. На дополненном корме мухам дают восстановиться после седации в течение 20 минут, удерживая пробирку в горизонтальном положении. Затем пробирку ставят вертикально в инкубатор с 12-часовым циклом освещения и темноты при температуре 25 °C на оставшееся время эксперимента.

Затем переверните стандартный флакон для мух и поместите его сверху на другой флакон, запечатав стык лентой для создания установки из двойного флакона. Затем разделите двойной флакон на три равных участка по 6,33 сантиметра, отметив круги вокруг флаконов перманентным маркером. После трех дней воздействия препарата перенесите мух в установку из двойного флакона.

Заменив ленту на шве, дайте мухам адаптироваться к новой среде в течение 15 минут. Затем поместите виалы на белый фон и настройте цифровую камеру. Убедитесь, что весь аппарат виден в одном кадре, что устройство с двойными виалами и таймер находятся в поле зрения, а все мухи находятся в фокусе.

Отметьте положение камеры и флакона, чтобы обеспечить единообразие кадров между повторностями; номер повторности и вид лекарственного препарата должны быть четко видны в поле зрения камеры. Затем трижды с силой постучите устройством с двойным флаконом по столешнице, чтобы все мухи опустились на дно флакона, и немедленно запустите таймер. Делайте снимок устройства каждые пять секунд в течение одной минуты.

Затем дайте мухам спокойно восстановиться в течение одной минуты. Повторите анализ еще два раза с одноминутным перерывом для восстановления между каждой попыткой. Просмотрите снимки и зафиксируйте количество мух в каждой секции с течением времени для проведения расчетов; восстановите три грамма мгновенной среды OPH, смешав её с 15 миллилитрами деионизированной воды и соответствующей дозой ротенона.

Через пять минут осторожно поместите пробирки вертикально в прозрачные флаконы и, сжимая пробирку, налейте твердую среду слоем в один сантиметр. Затем аккуратно прижмите пластиковую крышку на конце пробирки, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. Усыпите однодневных самцов мух углекислым газом и осторожно перенесите по одной мухе в каждую пробирку с помощью кисточки.

Затем заткните конец пробирки маленьким ватным тампоном. Оставьте мух в горизонтально расположенных пробирках на 15 минут для восстановления после воздействия диоксида углерода и убедитесь, что все особи живы и активны. Поместите пробирки в монитор активности дрозофил (drosophila activity monitor, DAM) и проверьте, чтобы все пробирки находились в одинаковом положении относительно DAM.

Поместите DAM в инкубатор с 12-часовым циклом свет/темнота при температуре 25 °C. Затем подключите DAM к системе сбора данных. После этого откройте настройки (preferences) в программном обеспечении DAM.

Выберите интервал объединения данных в 10 минут, запустите сбор данных и позвольте программе собирать данные в течение семи дней. Затем откройте программу сканирования DAM-файлов и перейдите к данным мониторинга, нажав «select input data». После этого выберите соответствующий диапазон мониторинга и установите интервал объединения данных равным 10 минутам.

Далее в поле «тип выходного файла» выберите «файлы каналов» (channel files), оставив все остальные параметры по умолчанию. Затем нажмите «сканировать данные» (scan data) и сохраните файлы в назначенную папку. В завершение импортируйте данные в программное обеспечение для анализа циркадных ритмов, чтобы получить значения количества импульсов в минуту.

После трех дней воздействия различных доз рооне, у мух дикого типа Canton S, подвергнутых воздействию повышенных доз, наблюдалось снижение стартового ответа. Меньший процент мух находился в верхней части и больший процент в нижней части аппарата через 30 секунд, что указывает на дефицит стартового ответа; аналогичная тенденция наблюдалась у мух в тесте на спонтанную локомоцию. Количество движений в минуту измеряли с помощью монитора активности дрозофил (DAM).

На четвертый день после воздействия у мух, подвергшихся воздействию 250 micromolar и 500 micromolar ротенона, наблюдается значительное снижение количества отсчетов в минуту. Данные анализы могут быть удобно адаптированы для характеристики нарушений локомоции в других моделях заболеваний пищевода и оценки эффективности терапевтических агентов.