Один канал сотового прилагается патч-зажим записи

Общая цель этой процедуры заключается в измерении электрического тока по одному ионному каналу. Это достигается путем первичной гетерологичной экспрессии интересующего ионного канала в клетках, с которыми легко работать и которые способствуют достижению экспериментальных целей. Второй шаг заключается в использовании отполированной огнем пипетки для получения стабильного уплотнения на клеточной мембране.

Далее экспериментатор должен определить количество каналов, присутствующих в патче, и если это одноканальный ток записи, то последним шагом является обработка и анализ данных. В конечном счете, запись тока от одиночных ионных каналов используется для исследования биофизических свойств, благодаря которым действуют эти мембранные белки, что составляет основу того, как нейронные и другие возбудимые клетки взаимодействуют. В отличие от методов, позволяющих измерять токи по нескольким активным ионным каналам, преимущество такого подхода заключается в том, что измерение токов по отдельному ионному каналу позволяет визуализировать и разделить широкий спектр характерных для того или иного канала паттернов отклика.

Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в области нейронауки, такие как физиологические и терапевтические модуляторы влияют на коммуникацию между нейронами. Как правило, люди, которые являются новичками в этой технике, испытывают трудности, потому что трудно получить записи с низким уровнем шума, содержащие только один ионный канал. Когда вы впервые пробуете этот метод, очень полезно увидеть, как кто-то это делает, потому что для получения действительно стабильного уплотнения, что является самым важным в этом методе, вам нужно осторожно подходить к клетке под определенным углом, и, что самое главное, вы должны быть настойчивы, чтобы подготовиться к трансфекции.

HEK 2 93 клетки помещаются в 35-миллиметровые чашки за один день до их слияния до 50-60% в стерильной пробирке. Приготовьте трансфекционную смесь. Добавьте по одному микрограмму каждой интересующей вас КДНК, 315 микролитров воды двойной дистилляции и 350 микролитров 42 миллимолярных куч.

Наконец, добавьте по каплям 35 микролитров хлорида кальция, чтобы образовался осадок. Вонзите трубку в течение пяти секунд и добавьте по 175 микролитров трансфекционной суспензии в каждую из четырех посуд. Сервирован накануне.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. После инкубации удалите среду и промойте PBS. Затем добавьте два миллилитра питательной среды, дополненной двумя миллимолярами хлорида магния, чтобы предотвратить опосредованную рецептором MDA эксайтотоксичность.

Сначала вытащите две симметричные записывающие пипетки из силикатного стекла мальчика с помощью вертикального пуллера. Далее необходимо провести огневую полировку для получения соответствующего диаметра и стойкости. Затем настройте запись, открыв программное обеспечение для сбора данных QUB и выбрав окно сбора.

Под версткой. Откройте новый файл данных QUB, щелкнув «Новые данные», и введите экспериментальные параметры, которые будут использоваться. Отрегулируйте масштабирование амплитуды до 0,1 вольта на пикоампер, щелкнув правой кнопкой мыши файл данных, выбрав свойства и щелкнув вкладку данных.

Заменив среду двумя миллилитрами PBS, содержащими кальций и магний, установите чашку с клетками на предметный столик микроскопа. Сосредоточьтесь на клеточном поле с помощью фазово-контрастной микроскопии, чтобы оценить, являются ли клетки здоровыми и хорошо прикреплены к чашке в виде монослоя. Переключитесь на обнаружение флуоресценции, чтобы убедиться, что трансфекция прошла успешно.

Далее задайте параметры для одноканальной записи. Установите режим на напряжение клещи и подаваемое напряжение на плюс 100 милливольт с помощью команды удержания напряжения. В выключенном положении выберите кнопку проверки герметичности на основе флуоресценции и общего внешнего вида.

Выберите ячейку для наложения, проверьте под фазовым контрастом, что клетка хорошо прикреплена к чашке, имеет большую часть поверхности клетки, открытую для наложения повязки, и в остальном выглядит здоровой. Наполните только что отполированную пипетку раствором, подходящим для NMDA-рецепторов и экспериментов с прикрепленными клетками, и осторожно проведите пальцем, чтобы удалить пузырьки воздуха. Закрепите записывающую пипетку на ведущем столике усилителя и убедитесь, что серебряная проволока погружена в раствор для пипетки, чтобы раствор для ванны не попал внутрь пипетки.

Во время подхода используйте небольшой пластиковый шприц, подключенный к держателю пипетки, чтобы аккуратно надавить на него. Далее с помощью микроманипулятора направьте пипетку в ванну. Замыкая электрическую цепь, расположите ее непосредственно над ячейкой, выбранной для коммутации.

Обратите внимание на осциллограф при входе в ванну. Сопротивление пипетки должно быть в оптимальном диапазоне при визуальном контроле положения трубки в микроскоп и ее электрического сопротивления на осциллографе. Продолжайте подход с небольшим шагом, пока пипетка не будет мягко касаться элемента.

Тестовый сигнал немного уменьшится, что указывает на повышенное сопротивление. Чтобы сформировать уплотнение, возьмите в руки шприц и осторожно надавите на него с небольшим отрицательным давлением через боковую трубку. При вытягивании плунжера шприца образование уплотнения плунжера происходит путем полного сплющивания формы сигнала испытательного сигнала на осциллографе.

На усилителе. Переключите переключатель внешней команды с проверки уплотнения в положение Выкл. Переключите команду удержания напряжения из выключенного в положительное и увеличьте коэффициент усиления с 10 x до 100x.

Наблюдайте за активностью канала в осциллографе, которая, если она присутствует, будет отображаться в виде квадратных отклонений вниз от ранее плоской базовой линии. Если на осциллографе отображается активность канала, начните сбор данных в ранее открытый цифровой файл в QUB, нажав кнопку воспроизведения, а затем кнопку записи. Чтобы остановить сбор данных, нажмите кнопку «стоп» в QUB и сохраните в файле QDF сигнал, который не полностью выравнивается, или базовая линия, которая становится зашумленной и неустойчивой, может указывать на слабую герметизацию.

В этом случае извлеките и выбросьте пипетку и повторите дальнейшие действия со свежей пипеткой до тех пор, пока не будет получена достаточная герметичность. Чтобы начать процесс анализа данных, откройте записанный файл данных в QUB и проверьте текущую трассировку в предварительном интерфейсе. Под версткой.

Снимите цифровой фильтр, чтобы отобразить записанную трассу в полной полосе пропускания, сняв флажок с надписью fc. Визуально отсканируйте след, чтобы выявить неровности и артефакты Краткое описание. Скачки тока можно скорректировать, выделив соседнюю чистую область того же класса проводимости.

Щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав «Сначала установить буфер стирания», увеличивайте масштаб пика, пока не станут видны отдельные точки выборки. Выберите область, которую нужно заменить, выделив только эту область. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Стереть», чтобы скорректировать базовую линию для всей записи.

Определите нулевую текущую базовую линию, выбрав раннюю часть записи, где базовая версия стабильна. Выделите правой кнопкой мыши и выберите «Задать базовую линию». Когда базовая направляющая появится, убедитесь с помощью визуального осмотра, что она точно отражает уровень базовой линии.

Определите точки в записи, в которых исходный уровень исходных данных заметно отклоняется от заданного базового плана. Исправьте это, выделив небольшой участок базовой линии в пределах отклоняющейся области. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите команду добавить базовый узел.

Если запись содержит случайные периоды с избыточным шумом или артефактами, которые не могут быть легко исправлены, эти части следует удалить, но сначала необходимо разбить их на последовательные сегменты. Выделите непосредственно перед областью, которую нужно отбросить. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите разрывной сегмент.

После этого выделите раздел, который нужно отбросить, щелкните правой кнопкой мыши, выберите, удалите и нажмите клавишу Enter, чтобы идеализировать записи. Переключитесь на интерфейс MOD под макетом. На панели отображения данных выберите небольшую часть записи, содержащую как закрытые, так и открытые события.

Переместите курсор на панель высокого разрешения ниже и в пределах выбранной трассировки выделите чистый сегмент, представляющий базовую линию. Переместите курсор на панель модели ниже, щелкните правой кнопкой мыши по черному квадрату, который будет представлять закрытое состояние, и выберите граб. Повторите процедуру для открытия каналов, выделив часть признаков, представляющих открытую проводимость.

Щелкните правой кнопкой мыши красный квадрат на панели модели и выберите grab. Выполните идеализацию для выбранной части записи, нажав кнопку SEL в разделе источник данных. Затем щелкните правой кнопкой мыши по идеальной вкладке под разделом моделирования на всплывающей панели.

Убедитесь, что требуемые параметры для анализа верны, а затем нажмите кнопку «Выполнить». Результат идеализации вместе с амплитудной гистограммой для выбранного участка накладывается на данные, позволяющие визуально оценить идеализацию. При необходимости настройте параметры идеализации для достижения наилучшего результата и повторите, выполните идеализацию для всего файла, выбрав кнопку Файл под источником данных.

Затем щелкните правой кнопкой мыши по идеализированной вкладке и нажмите «Выполнить». Отобразятся результаты для всего файла. Наложив на них данные, внимательно проверьте соответствие между идеализированной трассировкой и записанными данными.

Иногда ошибочно идентифицируются события, которые могут быть исключены из идеализированной трассировки. Выберите событие false правой кнопкой мыши и выберите «Присоединиться к IDL». Здесь показаны токи только ионов кальция через один NMDA-рецептор в клетке HEK 2 93.

Используя технику прикрепленного к ячейке патч-зажима, идеализация данных позволяет получить амплитудные гистограммы, которые хорошо вписываются в два различных класса проводимости в этой ячейке. Подключена запись с HEK 2 93 ячейки, один меночувствительный канал активируется на минус 20 миллиметров. Давление ртути через патч-пипетку при постоянном приложении напряжения.

Красной пунктирной линией обозначен нулевой уровень тока. Эти записи из нативных каналов показывают непрерывную активность NMDA-рецепторов, записанную из сомы нейрона, который был отделен от префронтальной коры эмбриона крысы и сохранялся в культуре в течение пяти или 27 дней. После мастеринга эта процедура может быть выполнена от 30 минут до одного часа в зависимости от продолжительности записи.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как кинетический анализ и моделирование состояния, для определения механизма стробирования канала и оценки скорости реакции. После просмотра этого видео у вас должно быть довольно хорошее понимание того, как записывать и начинать анализ токов через белок одного ионного канала.