Метод проницаемости от Дрозофилы Эмбрионы для анализов малых молекул деятельности

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы получить жизнеспособные эмбрионы дрозофилы с проницаемой яичной скорлупой для проверки биологической активности вводимых низкомолекулярных лекарств или токсинов. Это достигается путем предварительной обработки эмбрионов на стадии развития разбавленным отбеливателем для удаления внешних слоев скорлупы яиц хориона. Второй шаг заключается в том, чтобы наполнить эмбрионы растворителем, который истощает тонкий воскообразный слой яичной скорлупы, блокирующий низкомолекулярные растворенные вещества.

Третий шаг заключается в обработке эмбрионов препаратом или токсином и красителем, чтобы одновременно измерить проницаемость яичной скорлупы и ввести в организм представляющее интерес. После дальнейшего развития эмбрионы могут быть либо непосредственно визуализированы, либо обработаны для иммуногистохимии. В конечном счете, результаты могут показать активность препарата или токсина на развитие тканей, как это определено с помощью флуоресцентной микроскопии с иммунореагентами или жизненно важными связями.

Сегодня я представлю наш метод проникновения эмбрионов дрозофилы для анализа активности малых молекул. Основные преимущества этой методики перед существующими методами заключаются в использовании обычных органических растворителей, таких как гептан для перма. Яичная скорлупа заключается в том, что наш растворитель для проникновения эмбриона, или EPS, пропускает воду и относительно нетоксичен.

Эти свойства облегчают обработку эмбрионов, благодаря чему воздействие растворителей может быть более точно контролируемо и может проводиться в физиологически значимых средах, что приводит к большей жизнеспособности эмбриона. Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я задумался о том, как удалить восковой слой яичной скорлупы. Будучи лыжником, я задумался о распространенном использовании цитрусового растворителя для удаления остатков воска с основания лыж.

Это побудило меня перевести данное приложение на яичную скорлупу эмбриона мухи, и после некоторых проб и ошибок привело к разрешению состава EPS, Prepare популяция клеток с не менее чем 500 мухами брачного возраста желаемых штаммов. В садки следует поместить 10-сантиметровый виноградный сок. Аэрирует с небольшим количеством дрожжевой пасты.

Меняйте эти пластины два раза в день. Через несколько дней мухи будут приучены к культуре и будут откладывать эмбрионы более регулярно. EPS состоит из поверхностно-активных веществ и растворов ограничивающих растворителей и годен в течение двух месяцев.

При хранении при комнатной температуре нагрейте поверхностно-активные вещества до 37 градусов Цельсия при смешивании свежего пенополистирола Для обработки пенополистирола эмбрионы обрабатываются корзинами, изготовленными из трех сантиметров, поэтому 50-миллилитровая полипропиленовая трубка и нейлоновая сетка шершавые. Пластиковые края легче приплавляются к сетке на последующих этапах разработки. С эмбрионами также обращаются с помощью корзинок, сделанных из крышек 50-миллилитровых пробирок.

Колпачок высверлен и надрезан, а резьба между колпачком и трубкой фиксирует сетку. В качестве альтернативы используется камера, изготовленная на местном оборудовании и подготовленная с помощью куска кислородопроницаемого материала. Сделайте мембрану закрепленной над отверстием с помощью фиксирующего кольца для забора эмбрионов.

Утром установите на культуру тарелку со свежей виноградной пастой с дрожжевой пастой. Через час поменяйте тарелку и выбросьте первую собранную тарелку. Пусть вторая пластина соберет эмбрионы в течение двух часов при температуре 25 градусов по Цельсию.

Затем соберите пластину и перенесите ее на 18 градусов Цельсия. Дайте эмбрионам развиться до нужной стадии. Когда эмбрионы будут готовы, защитите их до обработки EPS.

Смойте их с тарелки в корзину для пюре с водой и с помощью кисти. Во-вторых, промойте их в щадящей проточной воде, чтобы удалить мусор. В-третьих, погрузите их в 50%-ный отбеливатель на две минуты с периодической циркуляцией раствора отбеливателя.

Затем быстро смойте их проточной водой. Теперь наполните шесть 60-миллиметровых чашек 10 миллилитров PBS каждая для функционирования в качестве ванн и сделайте 1 к 40 разбавлений запаса EPS в MBIM. Образуется белая эмульсия, промокните лишнюю воду со дна сетчатой корзины с помощью салфетки и погрузите зародыши в разведенный пенополистирол постоянными вихревыми движениями.

После закручивания эмбрионов в ЭПС в течение 30 секунд извлеките их и промокните излишки раствора. Затем переместите корзину между шестью ваннами PBS, аккуратно распыляя, чтобы промыть и приступить к окрашиванию и медикаментозной обработке. Оптимизация проницаемости и жизнеспособности является самой сложной частью этого протокола.

Проницаемость чувствительна к стадии развития эмбриона. Температура, при которой созревают эмбрионы, также может сильно варьироваться в зависимости от отдельных штаммов мух. Наилучшие параметры для разбавления ЭПС и времени воздействия должны быть получены эмпирическим путем.

Сначала приготовьте 50 микромолярный раствор научно-фантастического красителя карбоновой кислоты в M-B-I-M-T достаточно одного миллилитра в микрофише. На этой стадии может быть добавлен токсин или лекарство для смешивания вихря для лечения острых состояний. Перенесите эмбрионы перма из корзины в микропробирку с помощью кисти.

Закройте трубку крышкой и переверните ее несколько раз. Затем загрузите пробирку в мутатор и дайте им инкубироваться в течение 15 минут. После того как зародыши приживутся, удалите краситель с помощью пипетки и добавьте обратно один миллилитр M-B-I-M-T для умывания. Ресус.

Приостановите эмбрионы, дайте им осесть и замените M-B-I-M-T. Затем проделайте так в третий и четвертый раз. После того, как четвертая промывка будет завершена, удалите все M-B-I-M-T и переместите эмбрионы в корзину для развития на длительные периоды развития.

Для корзины для разработки сначала приготовьте корзину с помощью промывки из 70% этанола, а затем ди воды, высушите кровь с помощью лабораторной салфетки. Когда закончите. Далее переложите корзину в 60-миллиметровую посуду с шестью миллилитрами инкубационной среды, содержащей нужный препарат или токсин.

Перенесите зародыши на сетку в корзину с помощью малярной кисти, аккуратно опустив на них инкубационную среду, диспергируйте зародыши в монослой. Будьте осторожны, чтобы не застрять пузырьки воздуха под сеткой. Чтобы использовать скользящую камеру, сначала подготовьте камеру, переверните ползунковую камеру и нанесите тонкую бусину вакуумной смазки по краю отверстия.

Затем загрузите 150 микролитров нужной среды на поверхность мембраны внутри отверстия. Теперь перенесите эмбрионы на среду с помощью кисти и распределите их по мембране. В завершение нанесите 25-миллиметровый круглый защитный накладку, разровняя среду.

Слегка надавите по периметру, чтобы обеспечить герметичность. Существует сильное влияние выращивания эмбрионов при температуре 18 градусов Цельсия на их способность проникать EPS и поглощать краситель на поздних стадиях развития. Это иллюстрируется отсутствием поглощения Rumine BD у эмбрионов, обработанных EPS, выращенных при температуре 25 градусов Цельсия

Динамическое распределение дальнего красного научно-фантастического красителя во время развития и его закрепление в желтке в развитом кишечнике, наблюдаемое с помощью синей автофлуоресценции, раскрывают критерий, используемый для оценки жизнеспособности. Научно-фантастический краситель также может определять проницаемость предшествующего эмбриона после фиксации формальдегида и иммуноокрашивания. После того, как эмбрионы EPS были обработаны научно-фантастическим красителем и токсином метилртути, их окрашивали Antifa 2, видимым зеленым цветом для маркировки моторных нейронов, и анти-E lab красным цветом для маркировки тел нейронных клеток.

Научно-фантастический краситель псевдоокрашен в синий цвет. Метилртуть оказывает влияние на структурирование тел клеток кортоновых нейронов, отмеченных стрелками на контрольных эмбрионах лечения. Эти нейроны имеют более упорядоченную фасциальную двойку, показанную здесь белым, иллюстрирующую нормальное разветвление сегментарных нейронов в контрольной обработке, отмеченной наконечниками стрел

Для сравнения, обработка метилртутью изменяет характер ветвления, отмеченный сплошными зелеными стрелками. Полая зеленая стрелка отмечает места, где разветвление было смещено. После освоения процедуры проникновения эмбрионов по этой методике могут быть выполнены примерно за 30 или 40 минут, если она выполнена правильно.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как фиксация и иммуноокрашивание эмбрионов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, на какие конкретные ткани нацелен препарат или токсин во время развития. Я благодарю вас за то, что вы наблюдаете за этой процедурой, и желаю вам удачи в применении этих методов в вашей лаборатории.