Экс естественных Культура Система по изучению развития щитовидной железы

Общая цель этой процедуры заключается в препарировании культуры ex vivo, мыши, эмбриональных имплантатов щитовидной железы или долей, чтобы можно было изучить морфогенетические и дифференцировочные события, происходящие во время развития щитовидной железы. Это достигается путем удаления сначала верхней челюсти и нижней части тела эмбрионального дня. E 12.5 - E 14.5 эмбрионы мышей для выделения шейной области эмбрионов.

На втором этапе удаляется нервная трубка, боковые ткани и язык, чтобы обнажить верхнюю часть трахеи и пищевода. Затем почка щитовидной железы, ее области или доли дополнительно очищаются от любых нежелательных тканей. На заключительном этапе имплантаты щитовидной железы помещаются в микролунку с покрытием или на фильтр.

В конечном счете, для изучения трехмерной организации эпителиального морфогенеза и фолликулов, васкуляризации имплантатов или дифференцировки предшественников щитовидной железы можно выполнить покадровую визуализацию, иммуноокрашивание или анализ экспрессии генов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы развития и дифференциации. Вопрос об организации клеток эпителия щитовидной железы в 3D, формировании просвета, дифференцировке клеток, поляризации и росте.

Демонстрировать процедуру будут аспирант Фидель Марсель и постдок Мила ЛаКорте из моей лаборатории в стерильном состоянии в ламинарном проточном колпаке. За два часа до выделения из ткани щитовидной железы разведите стерильный коллаген первого типа до 50 мкг на миллилитр. Конечная концентрация в 10 миллимолярах хлористого водорода и поместите коллаген на лед.

Затем залейте каждую из лунок пластиковой камеры для культивирования 200 микролитрами разведенного коллагена и инкубируйте камеру при комнатной температуре. Через два часа отсасывайте коллаген. Промойте лунки средой М1 99 и добавьте в каждую минимальный объем 200 микролитров питательной среды. Поместите покрытые покрытием камеры в инкубатор, а затем приступайте к вскрытию щитовидной железы.

Сначала поместите рассеченную матку в 10-сантиметровую пластину, содержащую HBSS. Затем с помощью щипцов удерживайте один конец матки, а затем откройте матку маленькими ножницами, чтобы последовательно освободить каждый из эмбрионов. С помощью ножниц отделите эмбрионы от плаценты, а затем перенесите эмбрионы внутри их дополнительных эмбриональных оболочек в новую 10-сантиметровую пластину, содержащую свежий HBSS.

Далее продолжайте вскрытие под стереомикроскопом для каждого эмбриона. Сначала извлеките желточный мешок и амнион. Затем проведя вольфрамовые иглы в стеклянных капиллярах в качестве ножа и вилки.

Удалите верхнюю часть головы, включая верхнюю челюсть и уши. Держите эмбрион на спине. Затем удалите лишний кусочек нервной трубки и после удалите нижнюю часть эмбриона прямо под передними конечностями и над сердцем.

Чтобы сориентировать ткань, перенесите срез эмбриона, содержащий язык и его шейную область, в новую 10-сантиметровую пластину, содержащую свежий HBSS, и удалите нервную трубку и ткани позади пищевода и трахеи. Теперь аккуратно разрежьте ткань срезом по обеим сторонам языка. Затем найдите пищевод и трахею, рассеките язык, оставив ретиноидный отек и ткани по обе стороны пищевода и трахеи.

После удаления языка рассеките пищевод и поместите трахею вентральной стороной вверх. Затем удалите нежелательные ткани, такие как тимус и все ткани, расположенные латерально к артериям дуги глотки. Затем для эмбрионов E 13.5 или E 14.5 визуализируйте доли щитовидной железы с каждой стороны трахеи и дополнительно рассеките доли от трахеи.

Для эмбрионов Е 12.5 диссекция может быть выполнена как показано только что до тех пор, пока не будут иссечены язык и пищевод. Затем, после обнаружения артерий дуги глотки, удалите все боковые ткани, как для эмбрионов Е от 13,5 до 14,5. Наконец, с помощью предварительно увлажненного фильтрующего наконечника на микропипетке P 200 перенесите изолированную ткань в 35-миллиметровую культуральную пластину, содержащую предварительно подогретую питательную среду.

Перед нанесением покрытия с 13,5 по 14,5 мм на щитовидную железу Х поясните. Сначала промойте ткань путем последовательного переноса в три лунки 24-луночного планшета, содержащего один миллилитр предварительно подогретой питательной среды, чтобы наложить доли на камеры с предварительно покрытым покрытием. Во-первых, аспирируйте питательную среду и с помощью микропипетки с отфильтрованными наконечниками аккуратно поместите по одной доле щитовидной железы в каждую из камер для культивирования.

Удалите лишнюю среду, а затем поместите камеру для культивирования в инкубатор для тканевых культур, чтобы экспланты могли прикрепиться к матрице. Затем, через два часа, аккуратно добавьте от 200 до 300 микролитров предварительно подогретой питательной среды в каждую лунку и поместите камеры обратно в инкубатор, чтобы покрыть область трахеи E 12,5 или доли щитовидной железы на полупористых фильтрах. Сначала заполните лунки 24-луночной пластины сотней 30 микролитрами предтеплой культуры.

Медиум нанесите фильтры на медиум. Следите за тем, чтобы пузырьки воздуха не задерживались ниже фильтра для культур. Затем с помощью микропипетки с отфильтрованными наконечниками осторожно перенесите контур или доли щитовидной железы и минимальный объем среды на центр каждого из фильтров максимум в четыре раза на фильтр.

Когда X-образные экспланеры попадают на фильтр, важно перенести их в центр фильтра с минимальным количеством среды, чтобы избежать контакта среды и создания мениска со стенкой фильтра. Наконец, удалите излишки среды и используйте вольфрамовую иглу для распределения контактов. Затем поместите их в инкубатор для культивирования тканей на срок до семи дней, меняя питательную среду через день под ламинарным проточным колпаком.

После одного дня в культуре на фильтре срединная линия на laa видна в виде удлиненной ткани, охватывающей верхнюю длину и образующей две доли с каждой стороны трахеи. При культивировании доли расширяются в процессе морфогенеза организации эпителиальных клеток в макроскопически видимые фолликулярные структуры. Как показано на этих изображениях, организация и поляризация екогерентных, положительных эпителиальных клеток могут быть визуализированы с помощью иммуномаркировки эзрином.

Со временем эзрин-положительные внутриклеточные структуры слились с полюсом клетки, который станет апикальным полюсом. Во время этого процесса эндотелиальные клетки с положительным результатом в четыре pcam пролиферируют и организуются вокруг развивающихся фолликулов, образуя ангиофолликулярные единицы. Для количественной оценки дифференцировки thro, цитов и С-клеток экспрессия генов может быть проанализирована с помощью R-T-Q-P-C-R РНК, выделенной из культивируемых долей щитовидной железы.

В то время как экспрессия фактора транскрипции щитовидной железы, NK X 2.1 не изменяется во время культивирования, экспрессия специфического тиреоглобулина и кальцитонина, специфичного для С-клеток, резко возрастает, что указывает на функциональную дифференцировку. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить рассечение и бактериологическое исследование щитовидной железы. Вы не готовы проводить эксперименты по приобретению и потере функций с использованием эмбрионов дикого типа или NOCO.