Статический Адгезия Анализ по изучению активации интегрина в Т-лимфоцитов

Общая цель этой процедуры заключается в количественной оценке клеточной адгезии. Это достигается путем первого покрытия 96-луночного микропланшета молекулами адгезии на втором этапе. Первичные Т-клетки человека выделяются из крови и мечаются CFSE.

Затем Т-клетки стимулируются с помощью лечения, чтобы повлиять на их адгезивность. На заключительном этапе обработанные клетки добавляются к микропланшету и происходит адгезия. В конечном счете, количество флуоресценции в лунке может быть измерено для определения процента адгезивных клеток в одном из условий обработки.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как добавление Т-клеток к модели и антерию, заключается в том, что не требуется совместное культивирование Т-клеток и erl-клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, например, как специфические препараты влияют на адгезию лимфоцитов? Хотя этот метод может дать представление о биологии линейной стопы, он также может быть применен к другим клеткам, таким как нейтрофилы.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы сложны для освоения и требуют точности и мастерства Чтобы закодировать микропланшет молекулами адгезии, начните с промывки 24 лунок 96-луночной пластины 50 микролитрами промывочного раствора, затем инкубируйте каждую лунку, за исключением контрольных лунок без покрытия, 50 микролитрами раствора покрытия в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Затем осторожно отсасывайте раствор покрытия, не допуская, чтобы наконечник пипетки касался дна лунок. Затем, промыв лунки еще 50 микролитрами промывочного раствора, инкубируйте микропланшет с 50 микролитрами адгезионного раствора на лунку.

Опять же, при 37 градусах по Цельсию. Через час осторожно отсадите адгезионный раствор и еще раз промойте лунки 50 микролитрами промывочного раствора. Чтобы изолировать Т-клетки, сначала тщательно перемешайте 50 микролитров коктейля для обогащения Т-клеток человека на каждый миллилитр цельной крови, а затем инкубируйте обработанную кровь в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем добавьте шесть миллилитров обработанной крови и такой же объем PBS без кальция и магния, обогащенного глюкозой 1%D, в 50-миллилитровую коническую пробирку комнатной температуры и осторожно перемешайте раствор.

Затем добавьте 15 миллилитров препарата лимфо в свежую 50-миллилитровую коническую пробирку и осторожно нанесите разбавленный образец крови на среду для выделения лимфоцитов. Отделите клеточные слои на 20 минут при 400 умноженных на G и 20 градусов Цельсия с отрывом. Затем с помощью свежей пасталистной пипетки удалите верхний слой, оставив слой лимфоцитов нетронутым на границе раздела.

Перенесите слой лимфоцитов в свежую коническую пробирку с помощью новой дозаторной пипетки. Добавьте девять миллилитров PBS к лимфоцитам, а затем равномерно распределите клетки по всей суспензии, аккуратно втягивая и вытягивая их. Раскрутите ячейки, а затем повторно суспендируйте гранулу в среде.

Затем дозируйте клетки в колбу с культурой T 75. 20 миллилитров питательных сред для стимуляции клеток после соответствующего периода культивирования. Сначала добавьте свободную сыворотку среду в 2,4 раза по 10 к шести Т-клеткам, а затем заморите клетки голодом в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия.

Через два часа раскрутите ячейки и снова суспендируйте гранулу. В одном миллилитре PBS пометьте клетки флуоресцентным маркером в темноте в течение восьми минут при комнатной температуре, а затем остановите реакцию, добавив 10 миллилитров 37 градусов Цельсия PBS. Затем, после раскрутки ячеек, повторно суспендируйте гранулу в 1,2 миллилитрах предварительно подогретого раствора для адгезии.

Нагрейте микропластину с покрытием до 37 градусов Цельсия, затем разделите ячейки на восемь аликвот по 150 микролитров в 1,5 градуса. Миллилитровые пробирки стимулируют одну пробирку с PMA в концентрации 10 нанограммов на миллилитр, чтобы она служила положительным контролем. Оставьте три пробирки необработанными для обслуживания регулятора стимуляции, немытого регулятора загрузки и регулятора для покрытия ICAM One и стимулируйте четыре пробирки различными концентрациями антител против CD three.

Затем немедленно аликвотируют 50 микролитров однократно 10-пятых клеток на лунку стимулированных клеточных смесей в соответствующие лунки в микропланшете и инкубируют планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Чтобы определить процент адгезивных клеток, сначала промойте каждую лунку 150 микролитрами теплого раствора для адгезии. Осторожно встряхните пластину в течение нескольких секунд, а затем осторожно отсасывайте среду из каждой лунки, не касаясь дна лунок наконечниками пипетки.

Повторите промывку три раза, меняя угол наклона пипетки при каждой аспирации. Затем включите считыватель пластин и откройте программу для считывания пластин в меню задач. Нажмите «Создать», чтобы настроить новый протокол.

Затем в меню действий выберите опцию чтения. Нажмите на интенсивность флуоресценции и нажмите OK. Введите длину волны возбуждения как 485, а длину волны излучения как 528.

Затем в оптическом меню выберите нижнюю часть и нажмите «ОК». Затем вернитесь в меню действий и установите температуру на 37 градусов по Цельсию и нажмите OK. Наконец, загрузите микропланшет и нажмите кнопку «Выполнить».

После экспорта результатов в электронную таблицу используйте формулу для расчета процента ячеек приверженности на этих изображениях. Приведен пример анализа адгезии с использованием первичных Т-клеток, стимулированных различными концентрациями анти-CD трех антител. Нестимулированные клетки служат в качестве негативного контроля.

Клетки, обработанные PMA, служат положительным контролем Для антител против CD трех в таблице отображены относительные интенсивности флуоресценции CFSE. Меченые первичные Т-клетки стимулировали различными дозами растворимых анти-CD трех антител и наносили на IAM одну покрытую лунку. Для каждого условия можно рассчитать среднюю интенсивность тройных скважин и перевести ее в относительный процент от общего количества загруженных ячеек.

В типичном эксперименте процент адгезивных клеток, обработанных PMA, составляет от 40 до 50%, в то время как процент нестимулированных клеток составляет от 5 до 10%. Обратите внимание, что процент адгезивных клеток увеличивается по мере увеличения концентрации анти-CD трех антител, используемых для стимуляции. После освоения эта техника может быть выполнена менее чем за три часа, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости измерения флуоресценции непромытого лунки, чтобы определить вход флуоресценции.

Критическое значение при анализе данных. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как количественно оценить статическую клеточную адгезию. Не забывайте, что работа с образцами человеческой крови может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение лабораторного халата и перчаток.