Использование флуоресцентных белков для мониторинга Glycosome Динамика в африканском трипаносомы

Общая цель данного эксперимента заключается в наблюдении за изменениями гликосостава в живых клетках в режиме реального времени. Это достигается за счет экспрессии флуоресцентного белка, слитого с последовательностью, нацеленной на Pero Somal PTs two. Слитый белок импортируется в зрелые гликозоны, которые становятся флуоресцентными органеллами.

Деградация и рециркуляция приводит к потере флуоресценции, которую можно контролировать с помощью потока Клетки цитометрии подвергаются воздействию различных условий окружающей среды, чтобы выявить факторы, которые запускают гликоремоделирование. Результаты показывают, что состав глико изменяется в ответ на изменения окружающей среды, основанные на изменениях клеточной флуоресценции при переходе клеток из бедных питательными веществами сред в среды, богатые питательными веществами. Таким образом, основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как электронная и флуоресцентная микроскопия, заключается в том, что он позволяет анализировать в режиме реального времени тысячи клеток.

Демонстрировать процедуру будут Сара Бауэр, аспирантка, и Меган Конлан, студентка бакалавриата из моей лаборатории. Проциклическая форма насекомых или паразиты PCF для этой процедуры культивируются в колбе для клеточных культур площадью 25 сантиметров квадратным сечением с 10 миллилитрами соответствующей среды при температуре 27 градусов Цельсия и 5% CO2. Подготовка плазменной ДНК не будет показана в этом видео, но протокол доступен в сопроводительной рукописи.

Чтобы начать эту процедуру, добавьте 10 микролитров стерильной очищенной линеаризованной ДНК к 400 микролитрам стерилизованных клеток цитосмеси с помощью проточного цитометра и соберите от 50 до ста миллионов клеток центрифугированием при давлении 800 G в течение 15 минут. При комнатной температуре слейте надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки объемом один миллилитр, чтобы ресуспендировать клеточную гранулу в 450 микролитрах смеси ДНК и Cyt. Переведите раствор, содержащий клетки, ДНК и цитосмесь в стерильный четырехмиллилитровый зазор.

Qve и поместите qve в камеру электропорации. Выберите экспоненциальный затухание и вручную введите следующие настройки. Напряжение 1,5 киловольта, емкость 25 миллиметров, бесконечная омега и вет четыре миллиметра.

Нажмите импульс, когда импульс завершится. Выньте ветеринара из камеры электропорации и вернитесь в бокс биобезопасности. Пипеткой нанесите 10 миллилитров среды SDM 79 в новую стерильную колбу.

Перенесите трансформированные клетки в колбу с помощью SDM 79. Инкубируйте клетки без выбора препарата в течение 24 часов. При 27 градусах Цельсия 5% CO2.

Через 24 часа G 4 1 8 гигромицин и бластин проходят. Один миллилитр трансформированных клеток с препаратом в девять миллилитров SDM 79 с препаратом возвращают клетки в инкубатор. Впоследствии клетки ежедневно анализируются с помощью проточной цитометрии, которая будет продемонстрирована далее в этом видео.

S для длительного хранения образуются, когда клетки флуоресцентны и достигли плотности 10 миллионов клеток на миллилитр. Во-первых, сделайте замораживающую среду, добавив равный объем 100% глицерина в смесь цито и отфильтруйте стерилизованный раствор. Далее добавьте 200 микролитров замораживающей среды к 800 микролитрам клеток в криопробирке и аккуратно перемешайте путем инверсии.

Поместите криопробирку между двумя штативами из пенополистирола и заморозьте при температуре минус 80 градусов Цельсия примерно на 24 часа. После замораживания перенесите клетки в жидкий азот, важно переместить клетки в жидкий азот Через 24 часа, так как более длительное хранение при температуре минус 80 градусов Цельсия приводит к снижению жизнеспособности клеток Разморозьте замороженный поголовье. Достаньте замороженный флакон из морозильной камеры с температурой минус 80 градусов по Цельсию и разморозьте комнатную температуру примерно 10 минут.

Пипеткой влейте девять миллилитров среды SDM 79 с препаратом в новую стерильную колбу. Добавьте в эту колбу размороженные клетки, проход к ячейкам от одного до 10, добавив один миллилитр этой культуры к девяти миллилитрам SDM 79 в новой колбе для подготовки культуры для разведения анализом прохода к клеткам с плотностью 100 000 клеток на миллилитр в трех миллилитрах SDM 79. В культуральной колбе объемом 25 мл флуоресцентная флуоресцентность измеряется сразу после прохождения, а затем через три часа и через 24 часа.

Когда клетки культивируются более чем за два прохода, лизосомальное ремоделирование становится непредсказуемым. Перед запуском любых проб жидкость должна быть промыта и промыта, как показано на рисунке. Здесь включите проточный цитометр и откройте программу C Flow plus.

Замените тюбик с наночистой водой, в котором хранится SIP, на пустую пробирку. Нажмите кнопку обратного смыва. Как только обратная промывка будет завершена.

Извлеките микроцентрифужную пробирку из глотка и выбросьте ее. Поставьте в глоток новую микроцентрифужную пробирку, содержащую один миллилитр новой наночистой воды. Выберите новую скважину в программе C Flow в соответствии с ограничениями по выработке.

Установите время на две минуты. В разделе Fluidics выберите fast и run. По истечении двухминутного лимита нажмите кнопку «Удалить образец данных».

После того, как проточный цитометр настроен, клетки можно подсчитать. Замените воду на СИП на пробу, которую нужно подсчитать. Установите ограничения бега на 30 секунд, fluidics на быстрый, а затем выберите бег после завершения 32-го лимита времени.

C Flow plus предоставит количество событий на микролитр под последним запуском. Чтобы измерить флуоресценцию, установите пределы прогона на 10 000 событий и флюидики. Чтобы замедлить работу, выберите установите пороговое значение.

В поле Основное пороговое значение выберите Окончательное удаление событий в FSCH и введите менее 30 000. Нажмите «Применить», а затем «Закрыть», нажмите кнопку гистограммы в одном из новых окон графика и выберите FSCA Из выпадающего списка выберите FL one A, который измеряет флуоресценцию. На длине волны 530 нанометров выберите run.

После того, как все культуры были оценены на флуоресценцию, пропустите чистящий раствор через линию жидкости в течение двух минут и воду в течение двух минут. Чтобы начать анализ данных, выберите вкладку «Анализ» в C Flow plus. Нажмите кнопку гистограммы ниже, создайте новый график.

Выберите FSEA. Появится выпадающий список. Выберите канал FFL один а.

Выделите скважину для анализа, выберите кнопку ворот и вручную нарисуйте ворота для интересующей популяции. C Flow plus обеспечит подсчет клеток в пределах этого затвора и процент проточной цитометрии этого графика клеток PCF, выращенных в глюкозосодержащих средах. SDM 79 выявил две популяции, одну яркую и одну тусклую.

Тусклые клетки содержат незрелые гликозоны, которые не импортировали флуоресцентный репортер. В то время как светлые клетки содержат более зрелые гликозоны, когда глюкоза присутствует в среде, неправильная локализация гликобелков приводит к летальному исходу, и экспрессия и импорт гликобелков должны строго контролироваться. Это выражается в отсутствии клеток с промежуточной интенсивностью флуоресценции.

В средах SDM 80 без глюкозы допускается неправильная локализация гликических белков. Бимодальное распределение популяций теряется, и наблюдаются клетки промежуточной флуоресценции. Эта система может быть использована для выявления условий, которые запускают гликоремоделирование.

При прохождении культур высокой плотности, содержащих примерно 10% тусклых клеток, или при прохождении в свежие среды, наблюдается увеличение процента тусклых клеток с незрелыми гликозонами, попадающими в левые ворота. К 24 часам исходное распределение населения восстанавливается. Поскольку незрелые гликопенки теперь содержат пероксисомные белки, необходимые для импорта флуоресцентного белка.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что следует избегать чрезмерного культивирования. После двух проходов культуры следует отбросить и использовать новые стабильные восьмерки. Этот протокол позволяет идентифицировать реагенты и условия, которые запускают гликомоделирование.

После этой процедуры могут быть выполнены другие лекарства, такие как западный анализ, флуоресценция и электронная микроскопия. Для того, чтобы более точно ответить на вопросы об изменениях в экспрессии, локализации и морфологии гликобелков.