Новый Разъяснение Метод визуализировать Желчная дегенерации Во печени Метаморфозы в море Минога ( Petromyzon Маринус)

Общей целью этой процедуры является уточнение всей печени и соединения с кишечником для глобального, структурного и клеточного анализа билиарной дегенерации. У метаморфической C миноги. Это достигается путем предварительной фиксации тканей в растворе гидрогелевого мономера.

Далее гидрогель полимеризуется вместе с неподвижными тканями. Затем плазматическая мембрана неподвижной ткани удаляется, и ткань становится прозрачной. Наконец, проводится иммунофлуоресцентное окрашивание, в конечном итоге лазерное окрашивание кожи, а конфокальная микроскопия используется для выявления глобальных структурных и клеточных изменений во время билиарной дегенерации при метаморфическом c Lampry.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в биомедицинской области, такие как коннектомы в центральной нервной системе, а в нашем случае — дегенерация желчевыводящих путей во время метаморфоза сывороточных точек. Применение этого метода распространяется на терапию или диагностику желчевыводящих путей человека или атрезии, поскольку это редкое врожденное заболевание младенцев имеет схожие характеристики с арной дегенерацией во время метаморфоза точки сыворотки крови. Впервые у нас появилась идея этого метода, когда мы нашли новостную статью в журнале Nature и представили онлайн-видео во время нашей лабораторной встречи, демонстрирующее процедуру, которую проведет Энн Скотт, аспирант нашей лаборатории.

В вытяжном шкафу приготовьте 400 миллилитров гидрогеля, смешав дистиллированную воду, 40% акриламида, 2% акриламида, 10 XPBS, 16% параформа, альдегид, сапонин и аммоний на сульфат. Приготовьте один литр очищающего раствора, состоящего из 4% SDS и 0,2 молярной борной кислоты, и внесите 500 миллилитров 80%-го глицерина для подготовки тканей в вытяжном шкафу. Изготовьте 10 миллилитров раствора гидрогелевого мономера в центрифужные пробирки объемом 15 миллилитров.

Препарируйте образец ткани и поместите ткань в каждую пробирку с гидрогелем, зафиксированным при температуре четыре градуса Цельсия на два дня. После инкубации под вытяжным шкафом полимеризуйте неподвижную ткань, добавив пять микролитров темида. Затем хорошо перемешайте и дайте образцам настояться при комнатной температуре в течение двух-трех часов.

После инкубации тщательно удалите излишки геля, чтобы очистить образцы тканей. Поместите каждый в 15 миллилитров очищающего раствора и выдерживайте при температуре 50 градусов Цельсия и 70 оборотах в минуту в течение нескольких дней, пока они не станут прозрачными. Меняйте очищающий раствор не реже одного раза в день и удаляйте излишки геля.

Перенесите образцы в 15 мл 0,1 молярного PB с 0,1% Triton X 100 при температуре 37 градусов Цельсия и 70 оборотах в минуту на ночь. Повторите инкубацию еще два раза со свежим буфером. Теперь, когда ткань очищена от излишков геля, погрузите образцы в первичное антитело в триттон PB X 100 и инкубируйте при 37 градусах Цельсия и 70 оборотах в минуту в течение двух дней после инкубации, используйте 15 миллилитров PB с 0,1% триттона X 100 для промывания образцов ткани при 37 градусах Цельсия и 70 оборотах в минуту в течение ночи.

Повторите промывку три раза после удаления буфера для окончательной промывки, добавьте флуоресцентный раствор вторичного антитела в PB с 0,1% Trix 100 и блокирующей сывороткой и инкубируйте в темноте при температуре 37 градусов Цельсия и 70 об/мин в течение одного дня. После трехкратной промывки образцов в 10 миллилитрах PB tritton X 100 при 37 градусах Цельсия и 70 об/мин в течение ночи, выполните три промывки в течение ночи в PBS. Наконец, инкубируйте осветленную ткань в 80% глицерине, покрытую фольгой, на ночь.

Затем конфокальная микроскопия выполняется при темном или тусклом свете, хотя в этом видео свет включен для целей визуализации. Во время метаморфоза c lampre в желчевыводящей системе HEPA происходит несколько важных событий развития, например, как показано здесь, желчный проток и желчный пузырь подвергаются апоптозу и дегенерируют. После использования модифицированного метода осветления и окрашивания маркером клеток печени цитокератином 19 анти-антиапоптотическим маркером, использовали двухлазерную сканирующую конфокальную микросхему БКЛ для выполнения оптического среза через интактную печень.

Окрашивание показало, что дегенеративный процесс протекает на метаморфических стадиях со второй по четвертую. Верхние панели находятся с переднего конца, а нижние - с заднего конца. Здесь показано билиарное дерево, а здесь темные дендритные апоптотические клетки и окружающие их каналы и инструменты протоков в печени.

На этом рисунке представлены трехмерные изображения, реконструированные конфокальные Z-ряды из трех печени между метаморфическими стадиями 2 и 3, помеченные антителами против цитокератина 19 и BCL два, желчное дерево и темные дендритные апоптотические клетки, а также окружающие каналькулы и инструменты протоков отмечены белыми и черными стрелками соответственно. Здесь показан конфокальный оптический срез желчных протоков образца между второй и третьей стадиями метаморфизма с каплями желчи в просвете. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как осветлить всю ткань для дальнейших визуализирующих анализов.

Не забывайте, что работа с параформом, альдегидом и полиакриламидными растворами может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и использование вытяжного шкафа.