Измерение осмотического водопроницаемость Коэффициент (P _F) Из сферических ячеек: изолированные протопласты растений в качестве примера

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы узнать о функции аквапоринов путем определения коэффициента осмотической водопроницаемости, или PF растительных протопластов. Вырежьте из листа кусочек без осевого эпидермиса и положите его на изотонический раствор. Переложите кусочки в ферментативный раствор и выдержите 20 минут при температуре 28 градусов Цельсия, затем в свежем изотоническом растворе.

Далее соберите протопласты, содержащие раствор, с обрезанным кончиком. В качестве второго шага подготовьте экспериментальную камеру. Прикрепите защитный лист к нижней части предметного стекла с помощью силиконовой смазки.

Затем обмазать дно камеры клеем, несущим положительный заряд, и заполнить камеру изотоническим раствором. Затем в камеру добавляют изолированные протопласты, и камеру аккуратно помещают на предметный столик микроскопа. Впоследствии протопласты подвергаются воздействию гипотонического раствора, в то время как записывается видео, чтобы зафиксировать ход их набухания.

Затем временной ход набухания численно анализируется с помощью программного обеспечения, включая процедуры подгонки, чтобы определить PF каждого протопласта на основе результатов численного анализа, которые показывают различия в PF, вызванные, например, экспрессией различных генов аквапорина. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области физиологии клеточных мембран, такие как регуляция функции аквапорина. Хотя этот метод может дать представление о матической воде, проницаемости водных растений растений, которые являются либо местными, либо генетически модифицированными.

Он также может быть применен к другим системам, таким как ide exposed origin of interest. Перед началом этой процедуры приготовьте необходимые изотонические и гипертонические растворы и проверьте их осмолярность. При использовании OSM oter осмолярность каждого решения должна быть в пределах 3% от целевого значения.

Наполните 10-сантиметровую чашку Петри примерно шестью каплями изотонического раствора. Очистите уплотнитель АББА или опустите эпидермис листьев кролика опсиса и разрежьте очищенный лист на квадраты примерно четыре на четыре миллиметра. Поместите мелкие кусочки на капли изотонического раствора открытой осевой стороной вниз и касаясь раствора.

Затем растворите 5,7 миллиграммов ферментной смеси в 165 микролитрах изотонического раствора в 1,5-миллилитровой пробирке и аккуратно перемешайте пипеткой в течение минуты или около того до полного растворения. Поместите несколько подобных капель ферментативного раствора в одну и ту же чашку Петри. Переложите кусочки листьев на ферментный раствор. Капли.

Закройте посуду и запечатайте крышку одним кругом перфила. Поставьте блюдо на водяную баню, установленную на 28 градусов Цельсия, на 20 минут. Через 20 минут добавьте в блюдо еще несколько капель изотонического раствора с помощью щипцов.

Поднимите каждый кусочек листа за край, чтобы перенести его в новый изотонический раствор капли, а затем последовательно перейдите ко второй капле. Встряхните кусочек листа во второй капле, чтобы освободить протопласты, используя отрезанный кончик пипетки объемом 100 микролитров. Соберите капли с протопластами в пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Приготовьте систему изозонии, заполнив одну колонку изотоническим раствором, а другую — гипотоническим раствором. Откройте клапан, чтобы дать течь гипотоническому раствору и заполнить трубку вплоть до впускного коллектора. Убедившись в отсутствии пузырьков воздуха, закройте клапан.

Повторите то же самое для изотонического раствора. Загерметизируйте защитное стекло силиконовой смазкой, чтобы сделать дно для камеры внутри предметного стекла из плексигласа, чтобы сделать дно камеры липким для протопластов, покройте его положительно заряженным сульфатом или поли-л лизином. С помощью наконечника пипетки нанесите этот клей на покровное стекло.

Подождите одну-две минуты. Промойте три-четыре раза изотоническим раствором и стряхните оставшийся раствор. Заполните камеру изотоническим раствором.

Затем с помощью отрезанного наконечника пипетки добавьте в камеру каплю протопластов, содержащих раствор. И подождите три-четыре минуты, чтобы протопласты осядили. Накройте камеру прозрачной крышкой, касающейся поверхности раствора.

Избегайте попадания пузырьков воздуха под ними. Аккуратно положите предметное стекло на перевернутый стол микроскопа и подсоедините его к перфузионной системе и насосу, защищая от пузырьков воздуха в трубке. Включите поток изотонического раствора для постоянной перфузии со скоростью один миллилитр в минуту.

Для записи изменений громкости выберите поле просмотра с максимально возможным количеством ячеек сферической формы и с хорошо сфокусированным контуром ячейки по наибольшему периметру. Запишите 62-е видео выбранных неподвижных протопластов со скоростью одно изображение в секунду или один герц. Начните запись с 15-секундного смывки изотонического раствора и переключитесь на гипертонический раствор на 45 секунд.

Сохраните фильм в формате Tiff в разделе Для анализа серии изображений набухающей клетки используйте плагины Image Explorer и анализатора протопластов в программе image J. Запустите изображение J.To откройте фильм, нажмите «Файл» на панели Image J, а затем последовательно в выпадающих меню по мере развертывания импорта. Затем проводник образов.

Выделите выбранный фильм. Кликните по нему правой кнопкой мыши, а затем влево. Нажмите на анализатор протопластов.

На первом изображении с помощью мыши нарисуйте круги вокруг выбранных протопластов. Затем нажмите OK. В таблице параметров обнаружения, которая появится для запуска алгоритма обнаружения протопластов, щелкните локальный на верхней панели изображения протопластов.

Затем обработайте. В выпадающем меню изучите зеленые кружки вокруг выбранных протопластов на протяжении всего фильма. С помощью нижнего ползунка сохраните результаты в файле Excel.

Анализ производится покадрово. Поэтому, в случае более чем одной ячейки, сортировка нужна для разделения линий, принадлежащих каждой ячейке Here. Три временных цикла отображаются на листе Excel до и после сортировки, а значения площади преобразуются из пикселей в квадратные микрометры.

Каждый курс затем экспортируется в отдельный текстовый файл. Чтобы начать эту процедуру, подключите камеру к системе перфузии и насосу и включите индикатор расхода матрицы на постоянную скорость перфузии один миллилитр в минуту, запишите 62-е видео с частотой в один герц. Начните запись с 15 секунд индикатора пла, а затем переключитесь на гипертонический раствор На 45 секунд остановите запись.

Заподлицо с индикатором. Снова умрите не менее чем на 30 секунд. Перед началом новой записи фильма сохраните пять-шесть фильмов для анализа видеороликов.

Чтобы получить средний временной ход изменения коэффициента пропускания индикатора штампа, запустите изображение J кликните по файлу. Затем откройте и найдите фильм. Для каждого фильма нарисуйте вертикальный прямоугольник шириной 10 пикселей в любом месте первого изображения фильма, нажмите на изображение на главной панели Image J.

Затем нажмите «Обрезать» в выпадающем меню. Чтобы выровнять 60 кадров в одном ряду, щелкните изображение, а затем последовательно щелкните в раскрывающихся меню, разворачивая стопки и выполняя монтаж. Нарисуйте горизонтальный прямоугольник высотой в один пиксель в любом месте всего ряда изображений и нажмите «Анализировать» на главной панели Image J.

Затем нажмите на профиль графика. В выпадающем меню скопируйте списки данных о коэффициенте пропускания в файл Excel. Усредняем временные курсы коэффициента пропускания, полученные из фильмов Sero индикатора промывки матрицы.

Создание базы в реальном времени путем умножения порядкового номера изображения на 0,1. Сохраните среднее время в текстовом файле для вычисления различных параметров временного хода осмолярности. Воспользуйтесь программой подгонки MATLAB PF fit, которая доступна для использования.

Бесплатно. Подробная информация о загрузке и использовании этой программы доступна в тексте протокола. В индикатор подойдет панель.

Импортируем данные о среднем временном ходе прохождения индикатора красителя. При ручном вводе текущих параметров эксперимента первоначальные предположения о параметрах с муравьем H. Описывая временной ход концентрации индикаторного красителя, также можно изменить. Нажмите кнопку «Запустить», чтобы просмотреть график временных ходов индикатора концентрации DAI и моделируемой осмолярности ванны.

Хорошее соответствие данным имеет важное значение для определения коэффициента водопроницаемости. Переключитесь на панель подгонки объема. Выберите для импорта файл данных области.

В качестве источника параметра выберите последнюю подгонку индикатора. Выберите класс модели. Начните с двух.

Параметры PF pf slow PF и delay должны быть инициализированы, например, как показано на рисунке, но возможны и другие значения. Маркировка проверяет все три устанавливаемых параметра. Нажмите кнопку «Выполнить».

Затем посмотрите на промежуточную цифру и при необходимости отрегулируйте параметр задержки и длину записи. Изучите график результатов, чтобы оценить посадку, качество и записать ошибку подгонки. Измените параметры инициализации в несколько раз каждый раз и запустите заново.

Повторите эту процедуру несколько раз, начиная с различных комбинаций параметров инициализации, стремясь к наименьшему значению ошибки подгонки, чтобы определить коэффициент водопроницаемости или pf, и сравнить активность различных аквапоринов Mesil Protoplast из опсисного листа кролика, которые были выделены и отдельно преобразованы с помощью трех генных конструкций с генами аквапорина от кролика, Opsys и Maze. Протопласты были помечены с помощью co-ran с вектором, кодирующим усиленный зеленый флуоресцентный белок. Для каждой клетки были получены временные ходы изменения объема клеток при воздействии гипотонической провокации, а также временной ход изменения осмолярности ванны во время гипотонической провокации, получены значения ПФ для каждой клетки.

С помощью программы PF FIT было замечено, что значения PF PROTOPLASTS, трансформированных каждым из трех аквапоринов, были значительно выше, чем PF контрольной клетки, трансформированной только GFP. Как только этот метод будет освоен, он сможет провести анализ нескольких десятков клеток за несколько экспериментальных дней, если он будет выполнен правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как определить водопроницаемость SMO в изолированных протопластах или других очаговых клетках, подвергнутых гипотоническому анализу.

Если у вас остались вопросы, пожалуйста, не стесняйтесь обращаться к нам.