Неинвазивная оценка сердечной патологии в экспериментальном аутоиммунного миокардита при магнитно-резонансной микроскопии изображений в мышь

Общая цель данной процедуры заключается в выявлении функциональных нарушений сердца путем визуализации сердец живых животных, страдающих воспалительными заболеваниями сердца. Это достигается путем первоначального индуцирования заболевания, например, миокардита. Вторым этапом является подготовка животного к магнитно-резонансной микроскопии и его помещение в специальный держатель для животных.

Затем мышь помещают внутрь магнита для получения изображений сердца. Заключительным этапом является анализ функциональных параметров сердца с помощью программного обеспечения Segment. В конечном итоге данный метод используется для расчета конечно-диастолического объема и фракции выброса у мышей с аутоиммунным миокардитом.

Главным преимуществом данного метода перед существующими, такими как гистопатология, является его неинвазивность и возможность получения трехмерного изображения сердца с высоким разрешением. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов кардиологии, связанных с диагностикой воспалительных заболеваний сердца. Как правило, специалисты, которые ранее не использовали данный метод, могут столкнуться с трудностями из-за недостаточного опыта в подготовке животных к получению микроизображений методом магнитного резонанса.

Поэтому визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение. Начните выполнение протокола с приготовления раствора пептида для индукции аутоиммунного миокардита: растворите пептид альфа-цепи тяжелого миозина сердца 3 34–3 52 в фосфатно-солевом буферном растворе до конечной концентрации 2 mg/1.5 mL. Затем приготовьте коклюшный токсин, добавив 1 mL стерильного 1x фосфатно-солевого буферного раствора во флакон, содержащий 50 µg лиофилизированного коклюшного токсина.

Для получения стоковой концентрации 50 нг/мкл возьмите 20 мкл стокового раствора в стерильную пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 980 мкл стерильного 1x фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) для получения рабочей концентрации 1 нг/мкл. Также приготовьте полный адъювант Фрейнда (CFA), добавив 40 мг экстракта mycobacterial tuberculosis H37Rv или MTB в 10 мл CFA для достижения конечной концентрации 5 мг/мл.

Теперь приготовьте эмульсию пептида с КФА: для получения аликвоты эмульсии объемом 1,5 мл поместите 750 мкл раствора пептида 3 34–3 52 тяжелой цепи альфа-миозина сердца в одну пробирку объемом 1,5 мл и отмеренный равный объем КФА с добавлением экстракта MTB в другую пробирку объемом 1,5 мл. Затем, используя шприц с Luer-Lock объемом 3 мл, наберите сначала раствор пептида, а затем КФА с экстрактом MTB. Присоедините шприц к трехходовому крану, а другой выход крана соедините с пустым шприцем объемом 3 мл.

Отрегулируйте положение крана, чтобы смесь пептида и CFA перетекала из одного шприца в другой с умеренным сопротивлением. Перемешайте смесь, несколько раз перенося ее содержимое из одного шприца в другой в течение примерно одной минуты, после чего поместите всю сборку на лед примерно на три минуты.

Повторите эту процедуру минимум 10 раз. Определите консистенцию эмульсии, осторожно поместив крошечную каплю в неподвижную воду в стеклянном стакане объемом 100 миллилитров. Капля не должна рассеиваться в воде; если это происходит, продолжайте перемешивание до достижения желаемой консистенции.

Перенесите содержимое эмульсии из трехмиллилитровых шприцев в одномиллилитровый шприц с Luer-lock, заменив один из двух трехмиллилитровых шприцев, присоединенных к трехходовому крану, на одномиллилитровый шприц. Затем прикрепите иглу калибра 27,5G.

Подкожно введите 150 мкл эмульсии пептида с CFA разделенными дозами в две паховые области самок мышей линии aj в возрасте от шести до восьми недель. Затем введите 100 мкл суспензии коклюшного токсина внутрибрюшинно каждому животному в нулевой и второй дни после иммунизации. Повторите процедуру иммунизации на седьмой день, введя 150 мкл эмульсии пептида с CFA разделенными дозами подкожно по обе стороны грудины.

Приготовьте данную эмульсию непосредственно перед использованием согласно описанному методу. Затем, на 21-й день, проведите МРМ-визуализацию животных. Для подготовки к визуализации поместите каждую мышь в камеру для индукции анестезии с воздушно-изофлурановой смесью (2% ISO) и используйте грелку для поддержания тепла.

Затем перенесите животное в специально разработанный держатель. Зафиксируйте голову с помощью прикусной планки, чтобы иммобилизовать животное в положении лежа на животе. Морда должна плотно прилегать к носовому конусу для поддержания анестезии.

Включите нагреватель с обдувом, вставив выпускной шланг в вертикальный порт сканера, чтобы поддерживать температуру тела животного во время эксперимента. На протяжении всего сеанса визуализации поддерживайте анестезию с помощью 1–2% изофлурана при скорости потока 2 мл/мин. Подтвердите состояние анестезии, проверив реакцию на зажим пальца лапы.

Затем установите пневматический датчик-подушку и ректальный температурный зонд для мониторинга дыхания и температуры тела на протяжении всего сеанса визуализации. Волоконно-оптический датчик пульсоксиметрии следует закрепить на левой лодыжке, зафиксировав стопу петлей из нити и пластырем для поддержания стабильного положения. Визуализация будет осуществляться с использованием синхронизации по сигналам дыхания и сердечного ритма без применения каких-либо контрастных веществ.

Для получения трехмерных изображений магнитно-резонансной микроскопии высокого разрешения следует использовать вертикальный широкоапертурный магнит с индукцией 9,4 Тесла. После подготовки животного поместите мышь в сканер так, чтобы сердце находилось в центре поля обзора. Затем запустите интерфейс визуализации, выберите в командной панели меню «тип нового исследования» (new study type), откройте страницу настройки (tune page), после чего выберите команды «запуск зонда» (start probe), «настройка» (tune) и «автомасштабирование» (autoscale).

Используйте ручки настройки и согласования (tune/match), расположенные в конце катушки, чтобы настроить РЧ-катушку на резонансную частоту протонов 400 megahertz. Затем перейдите на страницу предварительного сканирования (pre-scan). Для выполнения калибровки частоты и мощности нажмите кнопку быстрого доступа x, Y, Z, чтобы открыть страницу шиммирования.

Затем выберите все итерации и выполните автоматическое шиммирование. Выберите скаут-последовательность. Измените поле обзора до 35 мм.

Оставьте остальные настройки по умолчанию и запустите последовательность. Если сердце находится не в центре поля зрения, отрегулируйте положение держателя животного, заново настройте РЧ-катушку и повторно получите скаут-изображение. Затем выберите последовательность gem.

Введите параметры сбора данных, указанные здесь на вкладке «acquire», чтобы получить две ортогональные плоскости вдоль короткой и длинной оси сердца. Затем выберите cine-последовательность для получения cine-изображений короткой оси с использованием датчика пульсоксиметрии и измерьте анатомические и функциональные параметры левого желудочка. Введите параметры, указанные здесь, чтобы получить cine-последовательность градиентного эха.

Отрегулируйте положение и угол срезов визуализации, основываясь на виде сердца вдоль длинной оси. Затем запустите последовательность. После завершения визуализации.

Преобразуйте полученные изображения в формат DICOM с помощью вкладки IO и перенесите соответствующие файлы в центр обработки данных для анализа. По завершении процедуры визуализации дайте животному очнуться после наркоза в клетке с фильтром-крышкой. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание в степени, достаточной для поддержания положения лежа на животе (стернального положения).

В данном случае для анализа анатомических и функциональных параметров левого желудочка используется программное обеспечение Segment. Начните с загрузки в программу кинопленок в формате DICOM. Затем выберите MRGE в качестве метода визуализации, cine в качестве типа изображения и короткую ось на уровне середины желудочка.

В режиме просмотра изображений укажите временные интервалы для конца диастолы и конца систолы, используя соответствующие подменю «set current timeframe to end diastole» и «set current timeframe to end systole» в меню «edit». Затем используйте кнопки команд «LV», а затем «endo» и «EPI» на нижней правой панели. Для ручного выделения левого желудочка, эндокарда и эпикарда соответственно удалите папиллярные мышцы, нажав соответствующую кнопку команды.

Для повышения точности расчетов считывайте количественные показатели левого желудочка, такие как диастолический объем, систолический объем, ударный объем и фракция выброса, на верхней правой панели. Затем используйте командную кнопку mis, а после нее командную кнопку измерительного штангенциркуля для измерения параметров левого желудочка, таких как толщина стенки и диаметр желудочка. В завершение обязательно используйте опцию сохранения обоих стеков изображений и сегментации, чтобы сохранить изображения, включая сегментацию в формате dot mat, для повторной обработки изображений при необходимости.

Здесь показан угол, под которым выполнялся срез сердца для получения изображения в двухкамерной проекции. Здесь мы видим примерно 1,5-кратное увеличение толщины левого желудочка, что указывает на структурные дефекты в сердцах мышей с экспериментальным аутоиммунным миокардитом по сравнению со здоровыми мышами. Сердечный выброс, измеренный на основе объема левого желудочка в диастоле и фракции выброса, был снижен у мышей с аутоиммунным миокардитом по сравнению со здоровыми мышами.

Наконец, сердца из указанных групп лечения были исследованы на наличие воспаления с помощью окрашивания гематоксилином, эозином и тоином; гистологическая оценка сердец мышей с миокардитом (в отличие от здоровых мышей) выявила мультифокальные лимфоцитарные инфильтраты. При выполнении данной процедуры важно следить за тем, чтобы температура тела животного оставалась постоянной, чтобы частота сердечных сокращений и частота дыхания существенно не менялись в ходе экспериментов. Это имеет решающее значение для получения воспроизводимых результатов.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о методе магнитно-резонансной микроскопии для оценки функциональных нарушений при воспалительных заболеваниях сердца, таких как миокардит у мышей. Однако не забывайте, что работа в сильных магнитных полях может быть чрезвычайно опасной, поэтому держатель для животных и другие компоненты должны быть немагнитными.