Глютамин поток изображений, используя Генетически кодируемые сенсоры

Общая цель данной процедуры заключается в визуализации транспорта глутамина через гетерологично экспрессированный транспортер в живых клетках с использованием сенсоров фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET). Это достигается путем трансфекции клеток COS-7 сенсором глутамина и транспортером. Сенсор состоит из FRET-донора, встроенного в бактериальный глутаминсвязывающий белок, и FRET-акцептора на C-конце этого белка.

Вторым этапом является настройка перфузионной системы и визуализация клеток в режиме реального времени с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа. Заключительный этап заключается в анализе полученных изображений и визуализации динамики глутамина. В конечном итоге с помощью этих FRET-сенсоров можно определить активность транспортеров в отдельной клетке.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как измерения на основе хроматографии, является значительно более высокое пространственно-временное разрешение. Данная методика состоит из трех этапов: трансфекции клеток сенсорными белками, визуализации в режиме реального времени и постэкспериментального анализа. В данном эксперименте используются семь клеток из-за их низкой эндогенной активности транспорта глутамина.

Рассейте клетки с плотностью примерно 70–80% в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки космического теленка (CCS) и 100 единиц на миллилитр пенициллина-стрептомицина в восьмилуночный стеклянный планшет. Инкубируйте при 37 °C, 5% CO2 и 100% влажности в течение 24 часов.

Через 24 часа замените ростовую среду на DMEM с добавлением 10% CCS без антибиотиков; культивируйте клетки в течение ночи при 37 °C, 5% CO2 и 100% влажности. В день трансфекции добавьте по 0,4 µg плазмидной ДНК, кодирующей глутаминовый сенсор и меченную флуоресцентным белком mCherry обязательную аминокислотную обменную систему ASCT2, в 50 µL безсывороточной среды.

Добавьте 1 µL реагента для трансфекции к 50 µL бессывороточной среды, аккуратно перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем смешайте раствор, содержащий ДНК, с разведенным реагентом для трансфекции и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут. Через 20 минут осторожно добавьте смесь реагента для трансфекции поверх клеток cost seven и аккуратно перемешайте, покачивая камеру.

Инкубируйте в течение 24 часов при 37 °C, 5% CO2 и 100% влажности. По истечении 24 часов замените среду на DMEM с добавлением 10% CCS и 100 единиц пенициллина-стрептомицина. Верните клетки в инкубатор перед началом перфузии.

Приготовьте перфузионные буферы от A до F согласно рецептам, приведенным в сопроводительной рукописи. Присоедините трехходовые краны к шприцам объемом 50 milliliter. Закройте краны и заполните шприцы перфузионными растворами.

Кратковременно откройте кран, чтобы заполнить его свободное пространство буфером. Затем включите восьмиканальную гравитационную систему перфузии с перфузионным карандашом и выберите ручной режим.

В меню выбора функции выберите соответствующий пункт. Поместите контейнер для отходов под перфузионный карандаш. Для успешного проведения эксперимента важно настроить перфузию таким образом, чтобы минимизировать дрейф и перенос раствора.

Вручную активируйте порты, нажимая соответствующие номера, и заполните трубки водой. С помощью шприца объемом 10 milliliter закройте порты, установите шприцы с буферами от A до F в порты с первого по шестой перфузионной системы и откройте краны. После этого.

Снова откройте порты, чтобы заменить воду в трубках буферным раствором. Скорость потока должна составлять около 0.8 milliliters per minute. Один раз нажмите кнопку отмены на контроллере перфузии, чтобы вернуться в меню выбора функций.

Переключитесь на опцию редактирования программы, затем введите протокол перфузии, указанный в данной таблице. Сохраните программу перфузии. Визуализацию клеток проводят через 48–72 часа после трансфекции.

Дважды промойте лунки чашки с стеклянным дном перфузионным буфером A, стараясь не смыть клетки. Установите чашку с стеклянным дном на предметный столик флуоресцентного микроскопа. Подключите систему перфузии к камере.

Если используется открытая камера, установите дополнительный насос для удаления перфузионного раствора из камеры. Откройте программное обеспечение для визуализации слайдов. Создайте новый слайд, используя функцию фокусировки, и найдите клетки, коэкспрессирующие сенсор и A SCT two M cherry, используя соответствующие наборы фильтров.

Отрегулируйте усиление, перейдя на вкладку камеры и переместив ползунок в разделе gain. Также установите значение нейтрального светофильтра в выпадающем меню neutral density filter. Нажмите image capture, а затем в окне сбора данных укажите фильтры, которые будут использоваться.

Изображения будут получены в трех каналах: возбуждение донора — эмиссия донора, возбуждение акцептора — эмиссия акцептора. Нажмите кнопку теста, чтобы отрегулировать время экспозиции, введя желаемое значение в поле рядом с настройками фильтров; для всех трех каналов время экспозиции должно быть одинаковым.

С помощью инструмента регионов выделите область интереса. В поле «тип захвата» (capture type) выберите «таймлапс» (time-lapse). Затем укажите интервал и временные точки для эксперимента.

Затем выделите область, не содержащую флуоресцирующих клеток, которую будут использовать для вычитания фона. Щелкните правой кнопкой мыши по выделенной области и назначьте ее фоном. В идеале в качестве фоновой области следует использовать клетки, не экспрессирующие сенсоры, чтобы учесть как аутофлуоресценцию, так и фоновую флуоресценцию, регистрируемую камерой.

Выберите нужную программу в опции select function run programs, переключитесь на сохраненную программу, а затем нажмите enter на контроллере перфузии. Теперь программа загружена; нажатие любой клавиши запустит перфузию, что позволит обеспечить одновременный старт перфузии и эксперимента по визуализации. Нажмите кнопку start в окне захвата одновременно с нажатием клавиши на контроллере перфузии.

Здесь представлены типичные эксперименты по изучению временной динамики с использованием клеток, коэкспрессирующих транспортер ASCT2 и FRET-сенсоры глутамина с аффинностью 8 мM и 100 µM. Приток глутамина определяется по изменению соотношения интенсивности флуоресценции донора m Turquoise 2 и акцептора Venus. Также продемонстрирован приток глутамина в присутствии аланина, который является субстратом.

Специфичность транспортеров также может быть изучена с помощью сенсоров. В данном случае клетки предварительно нагружали глутамином, после чего в экстрацеллюлярный перфузат добавляли различные аминокислоты. Как и ожидалось, восемь субстратов A ct two индуцировали поток глутамина, в то время как аминокислоты, не являющиеся субстратами, этого не вызывали.

Отсутствие изменений эффективности FRET при добавлении субстрата может быть обусловлено несколькими причинами, например, низкой способностью к поглощению тестируемого субстрата, что наблюдалось в клетках, экспрессирующих 8-миллимолярный или 100-микромолярный сенсоры. Однако для подтверждения того, что изменение эффективности FRET вызвано именно изменением концентрации субстрата, а не изменением других параметров, используются клетки, не экспрессирующие транспортер sCT2. Тот же протокол перфузии выполняется с использованием клеток, экспрессирующих сенсор, который, как ожидается, будет насыщен в данных экспериментальных условиях.

В данном примере аффинность сенсора составляет 1,5 micromolar. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как визуализировать динамику метаболитов с помощью FRET-сенсоров. Не забывайте, что с клеточными культурами следует обращаться надлежащим образом в соответствии со стандартными операционными процедурами, чтобы свести к минимуму риск воздействия.