Изучение ДНК Looping на одиночных молекул FRET

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы исследовать, как внутренняя форма ДНК влияет на динамику петли двухцепочечной ДНК без использования ДНК-связывающих белков. Это достигается за счет включения молекул красителя в двухцепочечные фрагменты ДНК различной кривизны, так что петлю ДНК можно контролировать с помощью флуоресцентного резонанса, передачи энергии или ладов. Обратимые события петли и расцикливания от отдельных молекул ДНК затем можно наблюдать с помощью микроскопии полного внутреннего отражения.

Скорость петли ДНК затем может быть экстраполирована из временных траекторий флуоресценции каждой отдельной молекулы. В конечном счете, можно измерить вероятность зацикливания ДНК по отношению к внутренней форме фрагмента. Основное преимущество этого анализа петли ДНК заключается в том, что он не полагается на ДНК-связывающий белок А, который может повлиять на кинетику петли ДНК А.

Простой протокол заключается в использовании метода, называемого флуоресцентным резонансным переносом энергии, и синтезе ДНК на основе ПЦР. Чтобы измерить вероятность появления ДНК, начните с проектирования глобально изогнутых ДНК путем повторения последовательности 10 MER. Например, эта репрезентативная последовательность представляет собой изогнутую ДНК из 186 пар оснований, где X — случайное дополнительное основание, а последовательности, фланкирующие повторяющуюся последовательность 10 mers, являются переходными последовательностями.

Затем проводят ПЦР с праймерами один и два с донором ладов SI три мечения праймера два на пятом простом конце. Затем проведите ПЦР с третьим и четвертым праймерами с мечением 5-го акцептора ладов SCI через основной остов и биотиновым линкером на пятом первичном конце третьего праймера. После очистки продуктов ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР смешайте три меченых продукта SCI и пять меченых продуктов SCI в буфере для обмена цепями в конечных концентрациях 0,4 микромоля и 0,1 микромоляра соответственно.

Затем инкубируйте нити при температуре 98,5 градусов Цельсия в течение двух минут, постепенно охлаждая до пяти градусов Цельсия со скоростью нарастания 0,1 градуса Цельсия в секунду, а затем инкубируя при пяти градусах Цельсия в течение двух часов. Чтобы заменить пряди для подготовки проточной ячейки, используйте сверлильный станок и алмазные сверла для создания шести-семи пар отверстий вдоль двух противоположных краев предметного стекла размером три дюйма на один дюйм. Когда все отверстия будут просверлены, потрите предметное стекло под струей воды, чтобы удалить видимый стеклянный порошок.

Поместите горки вертикально в стеклянную банку и залейте ее дистиллированной водой. Проработайте банку ультразвуком в течение 15 минут, а затем переложите предметные стекла в стеклянную банку, предназначенную для очистки ацетоном. Наполните банку ацетоном и обработайте предметные стекла в ацетоне еще 15 минут.

Затем сбрызните горки этанолом, а затем водой, чтобы промыть их, а затем переложите горки в полипропиленовую банку. Заполните полипропиленовую банку гидроксидом калия на пять моляров, а затем обработайте слайды ультразвуком еще 15 минут после последней стирки, промойте слайды в дистиллированной воде, после чего еще 15 минут. Ультразвуком затем после чистки крышка соскальзывает.

Таким же образом нанесите 80 микролитров свежеприготовленного раствора ПЭГ на каждую горку, а затем аккуратно опустите на колышек защитный листок. Через 45 минут с помощью пинцета снимите покровные стекла с предметных стекол, промойте стекла и покровные стекла обильным количеством дистиллированной воды. Затем высушите их в влагопоглотителе, когда покровные стекла высохнут, положите тонкие полоски двойной клейкой ленты поперек предметного стекла, чтобы сформировать каналы, нанесите на полоски защитный лист и плотно надавите на защитное стекло, чтобы образовались жидкие герметичные каналы.

Затем используйте пятиминутную эпоксидную смолу, чтобы запечатать края каналов, чтобы обездвижить молекулы для микроскопии. Сначала введите 15 микролитров раствора neu tradin в один канал. Через две минуты промойте канал 100 микролитрами буфера T 50, а затем введите в канал 50 микролитров образца ДНК.

Через пять минут промойте несвязанную ДНК 100 микролитрами буфера T 50, а затем заполните канал буфером для визуализации, который содержит систему поглощения кислорода. Теперь нанесите иммерсионное масло на объектив микроскопа, а затем с помощью зажимов для образцов прикрепите проточную ячейку к предметному столику микроскопа. Включите лазер с яркостью 532 нанометра.

Используйте просмотр флуоресцентных изображений на мониторе в режиме реального времени для уточнения. Отрегулируйте фокусировку. Начните сбор данных с включенным лазером 532 нм.

Остановите сбор данных, когда большинство молекул обесцвечены для обработки и анализа изображений, используйте скрипт MATLAB для просмотра всех временных трасс одной молекулы, которые показывают множественные переходы между сигналами высокого и низкого ладов. Определите закольцованное и незамкнутое состояния, а затем найдите порог, разделяющий два распределения, определив пересечение между двумя аппроксимированными гауссовыми кривыми. Затем рассчитайте эффективность фронта F, разделив интенсивность научной фантастики на сумму интенсивностей SCI, трех и научно-фантастической.

Назначение состояний петли с высокими значениями ладов и состояний расцикла с низкими значениями ладов. Затем с помощью скрипта MATLAB проанализируйте совокупное количество молекул или NFT, которые зациклились, то есть достигли высокого состояния лада в разные промежутки времени. С момента начала сбора данных подцикл K может быть затем извлечен путем подгонки NFT экспоненциальной функцией.

Если NFT увеличивает bi, в основном его можно насадить с помощью двойной экспоненциальной функции, как показано в уравнении. В этом случае из этого уравнения получается подконтур K для определения потока J-фактора. 20 микролитров от 30 до 50 пикаМоляр биотина sci пять олиго или праймер три в один из каналов, покрытых ореховым покрытием, как только что продемонстрировано.

Затем промойте канал 100 микролитрами T 50, чтобы смыть несвязанные олиго, а затем влейте в камеру свежеприготовленный буфер для визуализации, дополненный PS three oligo. Оставьте лазер 532 нанометра включенным, а затем кратковременно включите лазер 640 нанометров, чтобы определить местоположение любых поверхностных научно-фантастических олигон. Затем выключите лазер на 640 нанометров и начните следить за сигналом лада.

Используйте скрипт MATLAB для анализа количества молекул, которые начинаются в несвязанном состоянии. То есть с низкой интенсивностью sci пять, но позже переходят в состояние IL. То есть, с высокой интенсивностью научной фантастики в зависимости от времени от трасс интенсивности научной фантастики, строит график зависимости этого числа молекул от времени, подгоняя кривую с одной экспоненциальной функцией для получения скорости Илинга.

K sub anil, повторите эксперимент при различных концентрациях олиго трех СИ, чтобы подтвердить линейность между скоростью стояния на колене и концентрацией реагента. Извлеките из наклона константу скорости колена второго порядка K prime sub ail. Наконец, рассчитайте J-фактор, где K sub loop — это скорость петли, измеренная в тех же буферных условиях, чтобы проверить влияние внутренней кривизны двухцепочечной ДНК на петлю.

В этом эксперименте использовалась одна прямая и одна изогнутая пара оснований 186. Каждая двухцепочечная ДНК была сконструирована по сравнению с прямой ДНК. Было установлено, что изогнутая ДНК производит больше событий высокого уровня ладов в течение того же периода времени.

Изогнутая ДНК также зацикливалась в четыре раза чаще, чем прямая ДНК за то же время сбора, демонстрируя, что внутренняя кривизна ДНК может существенно влиять на динамику петли. На этом заключительном этапе анализа J-фактор был рассчитан путем деления скорости петли на первый порядок, постоянную скорости коленопреклонения, и был определен равным 61 плюс-минус три аномоляра для прямой ДНК и 265 плюс-минус 48 наномоляров для кривой ДНК в соответствии с предыдущими результатами. После этой процедуры можно изучить влияние факторов аварии на подвижность петли, таких как температура, ненапряженность и вязкость.

Этот протокол будет полезен не только для изучения физики полимеров ДНК, но и для демонстрации силы флуоресценции одной молекулы начинающим студентам-исследователям или непрофессиональной аудитории.