Анализ ущерба эпителиальных Продюсеры

Общая цель данной процедуры заключается в оценке ранних взаимодействий между хозяином и патогеном, а также инвазивного потенциала TBA.Histolytica. Сначала подготовьте препараты интактных трофозоитов, трофозоитов, общих лизатов или секретов трофозоитов. Затем инкубируйте эпителиальные клетки хозяина с соответствующими концентрациями различных типов трофозоитов.

Теперь с помощью иммунофлуоресценции с использованием антител проанализируйте обработанные культуры эпителия на наличие специфических белков E. histolytica, которые взаимодействуют с плотными контактами эпителиальных клеток; также измерьте изменения парацеллюлярного барьера с помощью трансэпителиального электрического сопротивления. В совокупности полученные результаты могут продемонстрировать разрушение плотных контактов под воздействием E. histolytica, а также точно определить участие конкретных комплексов в этом процессе. Основными преимуществами данного метода являются использование различных продуктов паразита для оценки транслокации факторов E. histo в эпителий хозяина, а также для демонстрации участия этих факторов.

Факторы открытия соединений целых клеток на очень ранних стадиях инфекции. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области изучения амебиаза, например, понять молекулярные взаимодействия между эпителием и паразитом. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, сталкиваются с трудностями из-за незнания подходящего времени инкубации, соотношения двух типов клеток для совместной инкубации, а также того, как получать различные продукты ЭЛИ и измерять TER.

Значение данного метода распространяется на терапию амиоза, поскольку такие вирусные факторы, как комплекс E-H-C-P-A-D-H 112, могут быть использованы в качестве мишеней в новых стратегиях лечения. Четверто. Данный метод in vitro позволяет получить представление об участии вирусного фактора Anica во взаимодействии с первичным сайтом в госпитале. Он также может быть применен к другим системам, таким как модели инфекции in vivo на хомяках, мышах, морских свинках, а также при исследовании биоптатов кишечника человека. Культура.

Клетки MDCK в 10 миллилитрах дополненной среды DMEM при 5% carbon dioxide и 37 degrees Celsius. Аутентично культивируют 1 times 10 to the fifth трофозоитов Entamoeba histolytica в 15 миллилитрах среды TYIS 33 при 37 degrees Celsius. Для открепления трофозоитов охлаждайте пробирку от пяти до 10 минут в ледяной водяной бане.

Затем асептически перенесите культуру в коническую пробирку и центрифугируйте при 360 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C. После этого осторожно слейте супернатант. Добавьте к осадку ледяной PBS и несколько раз переверните пробирку, чтобы ресуспендировать клетки после центрифугирования.

Определите количество трофозоитов с помощью гемоцитометра; для лизиса трофозоитов проведите мгновенную заморозку в жидком азоте в течение одной минуты, разморозьте при температуре 4 °C и интенсивно перемешайте на вортексе. Затем активируйте протеазы, присутствующие в лизатах, с помощью 0,02% бета-меркаптоэтанола. Разведите 9 × 10⁶ трофозоитов в 3 мл ледяного PBS и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл.

Теперь поместите суспензию трофозоитов в инкубатор при температуре 37 °C на два часа, расположив пробирку горизонтально под углом пять градусов, для сбора секретируемых продуктов, после чего центрифугируйте пробирку при 360 ×g в течение 10 минут. Используя одноразовый стерильный шприц, осторожно соберите супернатант, избегая загрязнения образцов трофозоитами из осадка. Затем, чтобы удалить любые перенесенные клетки, пропустите супернатант через целлюлозно-ацетатную мембрану с размером пор 0,22 мкм.

Теперь активируйте протеазы 0,02% beta-меркаптоэтанолом для иммунофлуоресцентного анализа культур. Клетки MDCK высевают на стерильные стеклянные покровные стекла в 24-луночный планшет для культивирования клеток. Контролируйте состояние клеток с помощью инвертированного микроскопа до достижения 100% конфлюэнтности.

Добавьте трофозоиты различных условий, разведенные в одном миллилитре подогретого PBS. Включите контрольные условия с клетками MDCK и PBS без E. histolytica, а также клетки MDCK с трофозоитами различных условий, но без инкубации с первичными антителами. Поместите культуральную пластину в инкубатор на 30 минут или на два часа.

Затем пять раз промойте эпителиальные клетки холодным PBS, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы или трофозоиты. Зафиксируйте и пермеабилизируйте клетки, добавив один миллилитр 96% этанола на несколько минут при температуре -20 °C в увлажненной камере. Осторожно извлеките покровные стекла из лунок.

Удалите излишки жидкости с края с помощью фильтровальной бумаги и погрузите покровное стекло клетками вниз в 0,5%BSA блокирующий раствор. Инкубируйте образцы в течение одного часа при комнатной температуре. Тем временем приготовьте смесь первичных антител в PBS.

Извлеките покровные стекла из блокирующего раствора. Удалите излишки жидкости с помощью фильтровальной бумаги. Перенесите клетки в раствор антител и инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 4 °C.

Промойте клетки пять раз по 1 мл PBS, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы. Затем приготовьте смесь двух флуоресцентных вторичных антител в PBS. Инкубируйте образцы со вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре в темноте для окрашивания ядер.

Инкубируйте клетки в течение трех минут с 200 µL 0,05 mM раствора dappy при комнатной температуре в темноте. Затем проанализируйте препараты с помощью конфокальной микроскопии, используя Z-стеки и XZ-плоскости в экспериментах по совместной инкубации. Для каждого экспериментального условия проведите инкубацию в течение 20 минут при 4 °C с использованием ингибиторов протеаз или культуры моноклональных антител.

Поместите клетки MDCK на стерильные проницаемые поддержки Transwell: в верхний отсек внесите 100 µL клеточной суспензии, а в нижний отсек — 600 µL дополненной среды DMEM. Поместите подготовленные фильтры Transwell в инкубатор на инвертированный микроскоп. Убедитесь, что клетки достигли 100% конфлюэнтности.

Соберите и объедините среду из верхнего отделения каждого трансвелла, чтобы получить 50 µL этой смеси сред. Добавьте 50 µL суспензии трофозоитов или контрольного PBS. Затем перенесите смеси в верхнюю камеру каждого трансвелла с клетками MDCK.

Немедленно погрузите два электрода STX в каждый трансвелл для измерения трансэпителиального электрического сопротивления. Убедитесь, что более длинный электрод касается дна нижней камеры, а более короткий электрод покрыт средой в верхнем отделении. E histolytica культивировали в условиях акклиматизации и собирали в конце логарифмической или в начале стационарной фазы роста.

В данном случае маркер плотных контактов ZO-1 использовался для визуализации контактов эпителиальных клеток, стабилизированных плотными и адгезивными контактами. Для изучения взаимодействия комплекса, производного от амебы, с поверхностью эпителия применяли иммунофлуоресцентный анализ с моноклональными антителами. Нанесение трофозоитов, полных лизатов или секретируемых продуктов на монослой эпителия приводило к колокализации комплекса с плотными контактами. Через 30 минут на границах клеток наблюдалось прерывистое окрашивание ZO-1 и его интернализация в везикулы.

Это нарушение было наиболее выражено в местах контактов клеток MDCK с трофозоитами. Конфокальная лазерная микроскопия общих лизатов показала, что комплекс вирулентности проникал в межклеточное пространство. Колокализация с нарушенным окрашиванием ZO-1 в точках контакта с паразитом привела к нарушению барьерной функции эпителия и снижению трансэпителиального электрического сопротивления на 90%.

Предварительная инкубация трофозоитов с антителами к комплексу или с ингибиторами протеаз привела к защите от снижения TER. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что и протеолитическая активность, и адгезивные свойства являются важными факторами вирулентности этого комплекса при инвазии E. histolytica. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как анализировать механизмы, с помощью которых факторы вирулентности E. histolytica открывают плотные контакты на ранних стадиях инфекции. При освоении данного метода анализ повреждения эпителия может быть проведен за три часа, при условии готовности продуктов лизиса и клеточных культур.

При выполнении данной процедуры важно строго соблюдать время взаимодействия ионов. Для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о возможных ассоциациях между факторами вирулентности E. histolytica и эпителиальными белками, после завершения данной процедуры можно провести другие методы, такие как иммунопреципитационный анализ. Эта методика открыла исследователям в области взаимодействий с гликокаликсом путь к изучению патогенеза амебной дисэнтерии у хомяков, морских свинок и в тканях человека.