Анализ ущерба эпителиальных Продюсеры Entamoeba гистолитика Инфекция

Общая цель этой процедуры заключается в оценке ранних взаимодействий патогенов хозяина и инвазионного потенциала TBA. Гистолитика. Сначала приготовьте интактные трофозоиты, трофозоиты, общие лизаты или секретируемые трофозоиты. Затем инкубируйте эпителиальные клетки хозяина с соответствующими концентрациями различных трофозоитов.

Теперь, используя иммунофлуоресценцию АМ, проанализируйте обработанные эпителиальные культуры на предмет выбранных белков ABA histolytica, которые взаимодействуют с плотными соединениями эпителиальных клеток, а также измерьте изменения парацеллюлярного барьера под действием трансэпителиального электрического сопротивления. В совокупности результаты могут продемонстрировать плотную разборку соединений с помощью TBA Histolytica, а также точно определить участие выбранных комплексов в этом процессе. Ключевыми преимуществами данной методики являются использование различных продуктов паразита для оценки транслокации гисто-факторов Eva в эпителий хозяина, а также для демонстрации участия этих эва

Его факторы на открытие соединения целых клеток в очень ранние моменты инфекции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области амебы, такие как понимание молекулярных взаимодействий между эпителиальными паразитами и паразитами див исли. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что они не знают подходящей пропорции времени инкубации двух клеток для совместной инкубации, а также того, как получать различные продукты ELI и как измерять TER.

Применение этого метода распространяется и на нашу терапию амисом, поскольку эти вир-факторы, такие как комплекс E-H-C-P-A-D-H 112, могут быть использованы в качестве мишеней в новых стратегиях лечения. Четыре. Этот метод in vitro может дать представление об участии вирусного фактора Anica в первоначальном взаимодействии в больнице. Он также может быть применен к другим системам, таким как inbivo, модели инфекций у мышей-хомяков, морских свинок, а также при биопсии кишечника человека. Культура.

Клетки MDCK в 10 миллилитрах дополняют среду DMEM с содержанием углекислого газа 5% и температурой 37 градусов Цельсия. Достоверно вырастить один раз в 10 до пятой части трофозоиты жерловой амебы histolytica в 15 мл TYIS 33, средними при 37 градусах Цельсия. Чтобы отделить трофозоиты, охладите трубку в течение 5-10 минут на ледяной водяной бане.

Затем асептически переложите культуру в коническую пробирку и центрифугируйте при 360-кратном перегрузке в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Теперь осторожно сцедите надосадочную жидкость. Добавьте в гранулу ледяной PBS и несколько раз переверните пробирку, чтобы разогнать клетки после центрифугирования.

Определите количество трофозоитов с помощью гемоцитометра, чтобы заморозить трофозоиты в жидком азоте на одну минуту, оттаять при четырех градусах Цельсия и энергично вихрить. Теперь активируйте протеазы, присутствующие в лизатах, с 0,02% бета-меркаптоэтанола. Разбавьте от девяти до 10 до шести трофозоитов в трех миллилитрах ледяного PBS и перенесите клетки в 50-миллилитровую коническую трубку.

Теперь поместите суспензию трофо под наклоном в пять градусов по горизонтали в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на два часа для сбора выделяемой продукции, центрифугируйте пробирку при 360-кратном перегрузке в течение 10 минут. С помощью одноразового и стерильного шприца тщательно соберите надосадочную жидкость, не допуская загрязнения образцов трофозоитами из гранулы. Затем, чтобы устранить любые перенесенные клетки, пропустите надосадочную жидкость через мембрану из ацетата целлюлозы толщиной 0,22 микрона.

Теперь активируйте протеазы 0,02% бета-меркаптоэтанола для иммунофлуоресцентной культуры. Клетки MDCK на стерильной стеклянной крышке помещаются внутрь 24-луночной чашки для культивирования клеток. Осматривайте клетки на инвертированном микроскопе до тех пор, пока они не достигнут 100% конфлюенции.

Добавляйте в разные кондиции трофозоиты, разведенные в одном миллилитре теплого PBS. Включают контрольные условия клеток MDCK с PBS и без e-гистолитики, а также клеток MDCK с различными состояниями трофозоитов, но испускающих инкубацию с первичными антителами. Поместите тарелку с культурой в инкубатор на две или 30 минут.

Затем пять раз промойте эпителиальные клетки холодным PBS, чтобы удалить несвязанные молекулы или трофозоиты. Зафиксируйте и промните клетки одним миллилитром 96% этанола в течение нескольких минут при температуре минус 20 градусов Цельсия во влажной камере. Осторожно вынимайте крышку из колодцев.

Удалите излишки жидкости с края с помощью фильтровальной бумаги и погрузите защитное стекло ячейками вниз в раствор, блокирующий 0,5% BSA. Инкубируйте образцы в течение одного часа при комнатной температуре. Тем временем приготовьте смесь первичных антител в PBS.

Поднимите крышку из блокировочного раствора. Высушите лишнюю жидкость на фильтровальной бумаге. Перенесите клетки в раствор антитела и инкубируйте образцы в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.

Промойте клетки пять раз одним миллилитром PBS, чтобы удалить несвязанные молекулы. Теперь приготовьте смесь двух флуоресцентных вторичных антител в PBS. Инкубируйте образцы во вторичных антителах в течение одного часа при комнатной температуре в темноте для ядерного окрашивания.

Инкубируйте клетки в течение трех минут с 200 микролитрами 0,05 миллимолярного раствора даппи при комнатной температуре в темноте. Теперь проанализируем препараты с помощью конфокальной микроскопии через срезы Зака и плоскости XZ в экспериментах по совместной инкубации. Используя ингибиторы протеазы или специфическое антитело, инкубируйте каждое экспериментальное состояние в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия с ингибиторами протеазы или культурой моноклональных антител.

Клетки МДК на стерильных трансвелл проницаемых опорах помещают в верхний отсек 100 мкл клеточной суспензии и в нижний отсек помещают 600 мкл дополненной среды DMEM. Поместите подготовленные трансвеллерные фильтры в инкубатор на перевернутом микроскопе. Убедитесь, что ячейки на 100% сливаются.

Соберите и скапливайте среду из верхнего отсека каждого транслунга до 50 микролитров этой смеси. Добавьте 50 микролитров суспензии трофозоитов или контроля PBS. Теперь перенесите смеси в верхнюю камеру каждого трансвелла, содержащего клетки MDCK.

Немедленно опустите два электрода STX в каждый трансвелл, чтобы измерить электрическое сопротивление трансэпителия. Убедитесь, что более длинный электрод касается дна нижней камеры, а более короткий электрод покрыт средой в верхнем отсеке. E. histolytica культивировали в условиях акцента и собирали в позднюю логарифмическую и раннюю стационарную фазы роста.

В данном случае маркер плотного перехода нулевой единицы был использован для визуализации клеточных контактов эпителиальных клеток, стабилизированных плотными и адгезионными соединениями. С помощью иммунофлюоресценции с моноклональным антителом изучали взаимодействие полученного комплекса амебы с нанесением на эпителиальную поверхность трофозоитов трофозоитов, общих лизатов или секретируемых продуктов к эпителиальному монослою, что приводило к колокализации комплекса с плотным соединением. Через 30 минут развилось прерывистое окрашивание ZO one на клеточных границах и интернализация в везикулах.

Это нарушение было наиболее заметным при контактах клеток MDCK с трофозоитами и трофозоитами. Конфокальная лазерная микроскопия общих лизатов показала, что комплекс вирулентности проникает в межклеточное пространство. Ко-локализация с нарушенным контактом с паразитом, окрашивающим zeO one, нарушила барьерную функцию эпителия и привела к снижению электрического сопротивления трансэпителия на 90%.

Предварительная инкубация трофозоитов с антителом к комплексу или с ингибиторами протеазы приводила к защите от приема капель TER. Вместе. Эти данные свидетельствуют о том, что как протеолитическая активность, так и адгезивные свойства являются важными факторами вирулентности этого комплекса во время инвазии e. histolytica. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как анализировать механизмы, с помощью которых EMBA histolytica вирусная в факторах открываются плотные соединения на ранних этапах инфекции Когда овладеть этим анализом повреждения эпителия можно будет через три часа, как только продукты EMBA и клеточные культуры будут готовы.

При прохождении этой процедуры важно помнить о точном времени взаимодействия ионов после этой процедуры. Другие методы, такие как иммунопреципитация, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как возможная связь между энба, факторами насилия гистолитики и эпителиальными белками после ее развития. Этот метод проложил путь исследователям в области взаимодействий альсиде для изучения патогенеза AMS у мышей-хомяков, морских свинок и в тканях человека.