Многоступенчатая Подготовка Техника восстановить нескольких метаболита классов соединений для углубленного и информационному Metabolomic анализа

Общая цель данной процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать эффективные средства фракционирования метаболитов в сложных биологических жидкостях с целью получения упрощенных образцов для улучшения охвата метаболома. Это достигается путем предварительного введения в каждый образец внутренних стандартов для контроля воспроизводимости подготовки образцов и условий прибора. Второй шаг заключается в добавлении ледяного метанола в каждый образец для осаждения белков, которые в противном случае могут помешать последующей хроматографии и анализу методом масс-спектрометрии.

Затем на этапе экстракции жидкой жидкостью гидрофильные метаболиты отделяются от гидрофобных. Заключительным этапом является твердофазная экстракция для дальнейшего фракционирования метаболитов липидов на фосфолипиды, жирные кислоты и нейтральные липиды. В конечном счете, этот комбинированный многоступенчатый метод используется для демонстрации эффективного разделения, превосходной воспроизводимости и улучшенного покрытия метаболома плазмы.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как простая экстракция метанолом, заключается в том, что мы получаем улучшенное покрытие метаболитов, особенно липидов, что важно при проведении исследований метаболомного профилирования или когда липиды представляют особый интерес. Перед выпадением белка подготовьте образцы, сначала разморозьте образцы до комнатной температуры. Затем приправьте образцы внутренними стандартами ISTD, которые были подготовлены заранее.

Все стандартные концентрации были скорректированы по мере необходимости в зависимости от чувствительности используемых приборов для МС и ВЭЖХ. Для анализа добавьте в каждый образец 10 микролитров. Каждый из гидрофильных и гидрофобных стандартных растворов вводит в каждый образец 10 микролитров либо одного x два x, либо четырех x положительного контрольного раствора.

После того, как все образцы были пропитаны внутренними стандартами и положительными контрольными растворами, сделайте вихревой обработкой каждый образец в течение 10 секунд. Чтобы начать осаждение белка, добавьте в каждый образец по 400 микролитров ледяного метанола. Вихревая в течение 10 секунд на каждую пробирку центрифуги при нуле градусов Цельсия в течение 15 минут при 18 000 раз.

G, Белковая гранула должна образоваться на дне трубки. После центрифугирования переложите всю надосадочную жидкость в новую стеклянную пробирку для культуры и затем просушите под азотом. Этот высушенный остаток позже будет подвергнут жидкой жидкостной экстракции.

Для анализа фракции белковых гранул добавьте один миллилитр эфира метилового жука или МТБЭ в белый или не совсем белый вихрь белковых гранул в течение 30 секунд на пробирку и центрифугируйте при нуле градусов Цельсия в течение 15 минут 18 000 раз. G сцедите слой МТБЭ в новую стеклянную пробирку для культуры. Поскольку размер гранулы будет варьироваться в зависимости от образца, важно последовательно отсасывать одно и то же количество МТБЭ для всех образцов.

Например, если для образца с наименьшим количеством надосадочной жидкости можно сцедить всего 900 микролитров, то сцеживают 900 микролитров. Для всех образцов добавьте еще один миллилитр МТБЭ в вихрь белковых гранул на 30 секунд, а затем центрифугируйте при нуле градусов Цельсия или 15 минут. Добавьте в 18 000 раз больше G, как и раньше, аспирируйте слой МТБЭ и добавьте в стекло пробирок для культуры подготовленных ранее.

Высушите образцы потоком азота и повторно суспендируйте в 200 микролитрах хлороформа метанола в соотношении один к одному. Перенесите каждый образец в центрифужную пробирку и центрифугу при нуле градусов Цельсия в течение 15 минут при 18 000 перечислении G. После этого используйте стеклянные пипетки для переноса надосадочной жидкости в флаконы с винтовой крышкой автопробника. Чтобы начать эту процедуру, с помощью стеклянной пипетки добавьте три миллилитра МТБЭ к подготовленному ранее высушенному остатку метанола и взбейте в течение 30 секунд.

После этого добавьте в каждую трубку по 750 микролитров воды и заведите вихрь на 10 секунд. Центрифугируйте при температуре около 200 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре, видны два отчетливых слоя После центрифугирования осторожно отасуньте 2,5 миллилитра верхнего слоя МТБЭ, не пипетируя водный слой ниже, и перенесите в чистую стеклянную культуру. Два. Добавьте три миллилитра МТБЭ к оставшейся водной части каждой пробы.

И вихревой 10 секунд на каждую пробирку центрифуги примерно в 200 раз больше G в течение 10 минут. При комнатной температуре отаскайте три миллилитра МТБЭ, не получая воды, и соедините с предыдущей трубкой МТБЭ. Позже эта фракция МТБЭ будет подвергнута твердофазной экстракции.

Оставшийся водный слой сконцентрировать путем сушки под азотом. Повторно суспендируйте остаток в 100 микролитрах одного, и добавьте 400 микролитров ледяного метанола в каждую пробирку вихря, а затем переложите в микроцентрифужную пробирку. Оставьте при температуре минус 80 градусов Цельсия на 20-30 минут, чтобы оставшийся белок выпал в осадок в метаноле.

Далее центрифугируйте при нуле градусов Цельсия в течение 15 минут при 18 000 раз G, где должен образоваться осадок вдоль боковой части пробирки, после центрифугирования отасадите 450 микролитров надосадочной жидкости без отсасывания осадок и переложите в чистую микроцентрифужную пробирку. Полностью высушите в вакуумном центробежном концентраторе при температуре не более 45 градусов Цельсия в течение одного-двух часов. Суспендируйте высушенную надосадочную жидкость в 200 микролитрах 5%-ной ацетилнитрильной воды и вихре

Кратковременно переложите образцы в автоматы, пробоотборники, флаконы и заморозьте при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы начать процедуру твердофазной экстракции, высушите полученную ранее фракцию МТБЭ при хорошем потоке азота при температуре от 35 до 15 градусов Цельсия в течение 10-15 минут. Когда фракции МТБЭ полностью высохнут, остановите поступление азота и быстро ресуспендируйте каждый образец в одном миллилитре хлороформа с помощью вихревой стеклянной пипетки.

Коротко промойте и дважды увлажните твердофазную экстракцию или картридж SPE с 400 микролитрами гексана. Выбросьте отходы и замените их новой стеклянной трубкой для сбора. Добавьте образец в колонку SPE, примените вакуум и соберите поток.

Стеклянной пипеткой добавьте в колонку SPE один миллилитр двух к одному изопропиловому спирту хлороформа и соберите сквозной поток в тех же стеклянных пробирках. Это нейтральная фракция. Просушите нейтральную фракцию под азотом в течение 10 – 15 минут.

Чтобы свести к минимуму окисление, с помощью стеклянной пипетки добавьте один миллилитр 5%-ной уксусной кислоты в этиловом эфире в колонку SPE и соберите сквозной поток. Это фракция жирных кислот. Высушите фракцию жирных кислот под азотом в течение 10-15 минут, чтобы свести к минимуму окисление, с помощью пластиковых наконечников.

Добавьте в картридж SPE 800 микролитров метанола и соберите поток через 15 миллилитровых пластиковых конических трубок, это и есть фосфолипидная фракция. Перенесите фосфолипидную фракцию в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра, высушите образцы вакуумным центробежным концентратором при температуре 45 градусов Цельсия в течение примерно от одного до 1,5 часов. Наконец, реус суспендирует каждый из образцов из трех фракций по 200 микролитров 100% метанола, переносит в авто, пробоотборник, флаконы и хранит в морозильной камере с отрицательным температурным температурой 80 градусов Цельсия.

Эффективность метода M-T-B-E-S-P-E в экстракции как липидных стандартов, так и эндогенных метаболитов продемонстрирована, в целом достигнута лучшая экстракция и охват метаболитов по сравнению с другими методами, такими как экстракция метанолом или экстракция только МТБЭ, когда количество признаков сравнивалось с использованием качественного и количественного программного обеспечения. После анализа lc MS сравнение фракций M-T-B-E-S-P-E показало минимальное перекрытие между тремя фракциями, следующими за SPE, что демонстрирует эффективность разделения гидрофобных метаболитов на соответствующие химические классы для более уверенной идентификации метаболитов. Кроме того, извлечение внутренних стандартов во фракции с использованием метода M-T-B-E-S-P-E, NR 12 продемонстрировало, что внутренние стандарты упоминаются во фракции, относящейся к их химическому классу.

Для оценки хроматографической воспроизводимости данных была проведена подготовка образцов на трех отдельных объединенных образцах контроля качества плазмы, и каждый образец был введен в трех экземплярах на приборе LCM MSS. Постоянное перекрытие демонстрирует воспроизводимость прибора и пробоподготовки. Увеличение химического шума, наблюдаемое в режиме отрицательной ионизации фракции жирных кислот, может быть связано с загрязнениями в растворителях LCM S.

Таким образом, анализировались только те метаболиты, которые упоминались до девяти минут. Не забывайте, что работа с хлороформом, МТБЭ, этиловым эфиром и даже наиболее распространенными реагентами, используемыми в этом методе, может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение лабораторного халата, перчаток и защиты глаз, а также выполнение подготовки образцов в вытяжном шкафу.