Многоступенчатая Подготовка Техника восстановить нескольких метаболита классов соединений для углубленного и информационному Metabolomic анализа
11 июля 2014 г.
Достоверность результатов в метаболомики экспериментов зависит от эффективности и воспроизводимости пробоподготовки. Описанный является строгим и в глубины метод, который позволяет при экстракции метаболитов из биологических жидкостей с возможностью последующего анализа до тысячи соединений, или просто сложные классы интерес.
Общая цель данной процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать эффективные средства фракционирования метаболитов в сложных биологических жидкостях с целью получения упрощенных образцов для улучшения охвата метаболома. Это достигается путем предварительного введения в каждый образец внутренних стандартов для контроля воспроизводимости подготовки образцов и условий прибора. Второй шаг заключается в добавлении ледяного метанола в каждый образец для осаждения белков, которые в противном случае могут помешать последующей хроматографии и анализу методом масс-спектрометрии.
Затем на этапе экстракции жидкой жидкостью гидрофильные метаболиты отделяются от гидрофобных. Заключительным этапом является твердофазная экстракция для дальнейшего фракционирования метаболитов липидов на фосфолипиды, жирные кислоты и нейтральные липиды. В конечном счете, этот комбинированный многоступенчатый метод используется для демонстрации эффективного разделения, превосходной воспроизводимости и улучшенного покрытия метаболома плазмы.
Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как простая экстракция метанолом, заключается в том, что мы получаем улучшенное покрытие метаболитов, особенно липидов, что важно при проведении исследований метаболомного профилирования или когда липиды представляют особый интерес. Перед выпадением белка подготовьте образцы, сначала разморозьте образцы до комнатной температуры. Затем приправьте образцы внутренними стандартами ISTD, которые были подготовлены заранее.
Все стандартные концентрации были скорректированы по мере необходимости в зависимости от чувствительности используемых приборов для МС и ВЭЖХ. Для анализа добавьте в каждый образец 10 микролитров. Каждый из гидрофильных и гидрофобных стандартных растворов вводит в каждый образец 10 микролитров либо одного x два x, либо четырех x положительного контрольного раствора.
После того, как все образцы были пропитаны внутренними стандартами и положительными контрольными растворами, сделайте вихревой обработкой каждый образец в течение 10 секунд. Чтобы начать осаждение белка, добавьте в каждый образец по 400 микролитров ледяного метанола. Вихревая в течение 10 секунд на каждую пробирку центрифуги при нуле градусов Цельсия в течение 15 минут при 18 000 раз.
G, Белковая гранула должна образоваться на дне трубки. После центрифугирования переложите всю надосадочную жидкость в новую стеклянную пробирку для культуры и затем просушите под азотом. Этот высушенный остаток позже будет подвергнут жидкой жидкостной экстракции.
Для анализа фракции белковых гранул добавьте один миллилитр эфира метилового жука или МТБЭ в белый или не совсем белый вихрь белковых гранул в течение 30 секунд на пробирку и центрифугируйте при нуле градусов Цельсия в течение 15 минут 18 000 раз. G сцедите слой МТБЭ в новую стеклянную пробирку для культуры. Поскольку размер гранулы будет варьироваться в зависимости от образца, важно последовательно отсасывать одно и то же количество МТБЭ для всех образцов.
Например, если для образца с наименьшим количеством надосадочной жидкости можно сцедить всего 900 микролитров, то сцеживают 900 микролитров. Для всех образцов добавьте еще один миллилитр МТБЭ в вихрь белковых гранул на 30 секунд, а затем центрифугируйте при нуле градусов Цельсия или 15 минут. Добавьте в 18 000 раз больше G, как и раньше, аспирируйте слой МТБЭ и добавьте в стекло пробирок для культуры подготовленных ранее.
Высушите образцы потоком азота и повторно суспендируйте в 200 микролитрах хлороформа метанола в соотношении один к одному. Перенесите каждый образец в центрифужную пробирку и центрифугу при нуле градусов Цельсия в течение 15 минут при 18 000 перечислении G. После этого используйте стеклянные пипетки для переноса надосадочной жидкости в флаконы с винтовой крышкой автопробника. Чтобы начать эту процедуру, с помощью стеклянной пипетки добавьте три миллилитра МТБЭ к подготовленному ранее высушенному остатку метанола и взбейте в течение 30 секунд.
После этого добавьте в каждую трубку по 750 микролитров воды и заведите вихрь на 10 секунд. Центрифугируйте при температуре около 200 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре, видны два отчетливых слоя После центрифугирования осторожно отасуньте 2,5 миллилитра верхнего слоя МТБЭ, не пипетируя водный слой ниже, и перенесите в чистую стеклянную культуру. Два. Добавьте три миллилитра МТБЭ к оставшейся водной части каждой пробы.
И вихревой 10 секунд на каждую пробирку центрифуги примерно в 200 раз больше G в течение 10 минут. При комнатной температуре отаскайте три миллилитра МТБЭ, не получая воды, и соедините с предыдущей трубкой МТБЭ. Позже эта фракция МТБЭ будет подвергнута твердофазной экстракции.
Оставшийся водный слой сконцентрировать путем сушки под азотом. Повторно суспендируйте остаток в 100 микролитрах одного, и добавьте 400 микролитров ледяного метанола в каждую пробирку вихря, а затем переложите в микроцентрифужную пробирку. Оставьте при температуре минус 80 градусов Цельсия на 20-30 минут, чтобы оставшийся белок выпал в осадок в метаноле.
Далее центрифугируйте при нуле градусов Цельсия в течение 15 минут при 18 000 раз G, где должен образоваться осадок вдоль боковой части пробирки, после центрифугирования отасадите 450 микролитров надосадочной жидкости без отсасывания осадок и переложите в чистую микроцентрифужную пробирку. Полностью высушите в вакуумном центробежном концентраторе при температуре не более 45 градусов Цельсия в течение одного-двух часов. Суспендируйте высушенную надосадочную жидкость в 200 микролитрах 5%-ной ацетилнитрильной воды и вихре
.Кратковременно переложите образцы в автоматы, пробоотборники, флаконы и заморозьте при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы начать процедуру твердофазной экстракции, высушите полученную ранее фракцию МТБЭ при хорошем потоке азота при температуре от 35 до 15 градусов Цельсия в течение 10-15 минут. Когда фракции МТБЭ полностью высохнут, остановите поступление азота и быстро ресуспендируйте каждый образец в одном миллилитре хлороформа с помощью вихревой стеклянной пипетки.
Коротко промойте и дважды увлажните твердофазную экстракцию или картридж SPE с 400 микролитрами гексана. Выбросьте отходы и замените их новой стеклянной трубкой для сбора. Добавьте образец в колонку SPE, примените вакуум и соберите поток.
Стеклянной пипеткой добавьте в колонку SPE один миллилитр двух к одному изопропиловому спирту хлороформа и соберите сквозной поток в тех же стеклянных пробирках. Это нейтральная фракция. Просушите нейтральную фракцию под азотом в течение 10 – 15 минут.
Чтобы свести к минимуму окисление, с помощью стеклянной пипетки добавьте один миллилитр 5%-ной уксусной кислоты в этиловом эфире в колонку SPE и соберите сквозной поток. Это фракция жирных кислот. Высушите фракцию жирных кислот под азотом в течение 10-15 минут, чтобы свести к минимуму окисление, с помощью пластиковых наконечников.
Добавьте в картридж SPE 800 микролитров метанола и соберите поток через 15 миллилитровых пластиковых конических трубок, это и есть фосфолипидная фракция. Перенесите фосфолипидную фракцию в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра, высушите образцы вакуумным центробежным концентратором при температуре 45 градусов Цельсия в течение примерно от одного до 1,5 часов. Наконец, реус суспендирует каждый из образцов из трех фракций по 200 микролитров 100% метанола, переносит в авто, пробоотборник, флаконы и хранит в морозильной камере с отрицательным температурным температурой 80 градусов Цельсия.
Эффективность метода M-T-B-E-S-P-E в экстракции как липидных стандартов, так и эндогенных метаболитов продемонстрирована, в целом достигнута лучшая экстракция и охват метаболитов по сравнению с другими методами, такими как экстракция метанолом или экстракция только МТБЭ, когда количество признаков сравнивалось с использованием качественного и количественного программного обеспечения. После анализа lc MS сравнение фракций M-T-B-E-S-P-E показало минимальное перекрытие между тремя фракциями, следующими за SPE, что демонстрирует эффективность разделения гидрофобных метаболитов на соответствующие химические классы для более уверенной идентификации метаболитов. Кроме того, извлечение внутренних стандартов во фракции с использованием метода M-T-B-E-S-P-E, NR 12 продемонстрировало, что внутренние стандарты упоминаются во фракции, относящейся к их химическому классу.
Для оценки хроматографической воспроизводимости данных была проведена подготовка образцов на трех отдельных объединенных образцах контроля качества плазмы, и каждый образец был введен в трех экземплярах на приборе LCM MSS. Постоянное перекрытие демонстрирует воспроизводимость прибора и пробоподготовки. Увеличение химического шума, наблюдаемое в режиме отрицательной ионизации фракции жирных кислот, может быть связано с загрязнениями в растворителях LCM S.
Таким образом, анализировались только те метаболиты, которые упоминались до девяти минут. Не забывайте, что работа с хлороформом, МТБЭ, этиловым эфиром и даже наиболее распространенными реагентами, используемыми в этом методе, может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение лабораторного халата, перчаток и защиты глаз, а также выполнение подготовки образцов в вытяжном шкафу.
Обзор
В данной статье представлен комплексный метод экстракции метаболитов из биологических жидкостей, повышающий надежность и воспроизводимость метаболомных исследований. Данная методика позволяет анализировать широкий спектр соединений, уделяя особое внимание метаболитам липидов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Метаболомика
- Подготовка биологических образцов
- Масс-спектрометрия
Теоретические основы
- Метаболомика опирается на эффективную подготовку проб для получения достоверных результатов.
- Сложные биологические жидкости требуют тщательного фракционирования для упрощения анализа.
- Существующим методам часто не хватает всестороннего охвата метаболитов.
- Усовершенствованные методы необходимы для профилирования, особенно в отношении липидов.
Цель исследования
- Продемонстрировать многоэтапный метод экстракции метаболитов.
- Расширить охват метаболома плазмы.
- Повысить воспроизводимость экспериментов в области метаболомики.
Используемые методы
- Добавление внутренних стандартов в образцы для мониторинга воспроизводимости.
- Осаждение белков с использованием ледяного метанола.
- Жидкостно-жидкостная экстракция для разделения гидрофильных и гидрофобных метаболитов.
- Твердофазная экстракция для дальнейшего фракционирования липидных метаболитов.
Основные результаты
- Описанный метод обеспечивает эффективное разделение метаболитов.
- Продемонстрирована отличная воспроизводимость результатов в различных образцах.
- Улучшен охват липидных метаболитов по сравнению с традиционными методами.
- Подтверждена эффективность метода для исследований по метаболомному профилированию.
Выводы
- Многоступенчатый метод экстракции значительно улучшает анализ метаболитов.
- Расширение охвата липидов имеет решающее значение для комплексных метаболомных исследований.
- Данный метод представляет собой надежный подход для исследователей в этой области.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Данный многоэтапный метод фракционирования метаболитов позволяет устранить критическую проблему метаболомики: непоследовательную подготовку проб, приводящую к получению недостоверных данных. Обеспечивая более полный охват липидных метаболитов и воспроизводимое разделение классов соединений, этот метод повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней и в рабочих процессах по поиску биомаркеров. Метод способствует снижению рисков при проверке гипотез на ранних стадиях исследования за счет химически обоснованного фракционирования, что напрямую влияет на приоритизацию портфеля в областях заболеваний, связанных с нарушением липидного обмена.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, основанные на роли липидов, путем разделения жирных кислот, нейтральных липидов и фосфолипидов для проведения направленного анализа.
- Операционная ценность: снижает неопределенность механизмов за счет обогащения проб по химическим классам, что обеспечивает более достоверную идентификацию метаболитов при выяснении путей биохимических реакций.
- Прогностическая ценность: повышает воспроизводимость за счет контроля извлечения внутренних стандартов во всех фракциях, что увеличивает надежность данных для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки при приоритизации мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать фракционированные образцы с пониженной химической сложностью, что обеспечивает более точное и чувствительное обнаружение малораспространенных метаболитов в ходе скрининговых кампаний.
- Эксплуатационная ценность: стандартизирует подготовку образцов для гидрофильных и гидрофобных фракций, повышая воспроизводимость анализа и пропускную способность метаболомных платформ.
- Стратегическая ценность: способствует повторному использованию платформы за счет получения фракций, пригодных для хранения (например, белкового осадка), для ретроспективного анализа, что повышает эффективность оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает поддержку систем, имеющих значение для изучения заболеваний, путем фракционирования плазмы, БАЛЖ и ЦСЖ — ключевых жидкостей в моделях воспалительных, нейродегенеративных и метаболических заболеваний.
- Операционная ценность: Обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации за счет стабильного охвата метаболитов и проведения фракционно-специфичного анализа.
- Минимизация рисков: Повышает прогностическую достоверность панелей биомаркеров за счет сокращения числа ложноотрицательных результатов при детектировании липидных метаболитов благодаря улучшенному извлечению специфических классов веществ.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум научных открытий — от проверки гипотез до идентификации перспективных соединений-лидеров, особенно в тех случаях, когда липидный обмен имеет механистическое значение для развития заболевания или ответа на лекарственную терапию.
- Открытие биологических мишеней: Способствует уточнению сигнальных путей и снижению биологических рисков путем выделения классов липидов, участвующих в передаче сигналов, воспалении и динамике мембран.
- Скрининг: Позволяет получать готовые к анализу фракции с количественными данными, подходящими для сравнения влияния соединений на липидный обмен.
- Аналитика: Обеспечивает возможность сравнения фракций посредством нормализации по внутреннему стандарту, что дает статистически достоверные результаты для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность доклинических исследований за счет фракционного анализа биомаркеров в биологических жидкостях, имеющих значение при заболеваниях, таких как спинномозговая жидкость и плазма.
- Повторное использование ресурсов организации: Позволяет использовать данный рабочий процесс как многократно применимый инструмент, при котором хранящиеся осадки и фракции позволяют проводить итерационный анализ без повторного экстрагирования.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышение достоверности прогнозирования при идентификации метаболитов за счет разделения по химическим классам и уменьшения перекрытия спектров.
- Операционная ценность: стандартизация и воспроизводимость благодаря использованию внутреннего стандарта и единообразному фракционированию различных типов образцов.
- Стратегическая ценность: более обоснованное принятие решений о продолжении или прекращении исследований за счет сокращения числа ложноотрицательных результатов при анализе липидных путей, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: приоритезация мишеней с учетом рисков на основе всестороннего охвата липидных метаболитов в моделях заболеваний.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области биохимии липидов и методов фракционирования для интерпретации результатов по конкретным классам липидов.
- Необходим доступ к центрифугированию, вакуум-концентраторам и стеклянной посуде, совместимой с хлороформом, MTBE и этиловым эфиром.
- Требуется межкомандная стандартизация объемов растворителей и протоколов аспирации для обеспечения воспроизводимости результатов на разных площадках.
- Предусматривает необходимость адаптации при работе с различными объемами образцов (вплоть до 50 µL) и различными жидкими матрицами, такими как плазма, БАЛЖ или СМЖ.
- Включает практические ограничения, такие как работа с опасными растворителями (хлороформом, MTBE, этиловым эфиром), что требует использования вытяжного шкафа и СИЗ.
