В Ситу обнаружения Аутореактивных CD4 Т-клеток в мозг и сердце Использование главного комплекса гистосовместимости Dextramers комплекс класса II

Общая цель данной процедуры заключается в выявлении самореактивных Т-клеток с высокой степенью специфичности с использованием MHC класса II декстромеров. В данном видео осуществляется забор тканей головного мозга мыши с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом, индуцированным протеолипидным белком миелина. Это достигается путем предварительного тщательного забора тканей и подготовки блоков для микротомии.

Вторым этапом является нарезание тканей, заключенных в агарозный блок, на срезы толщиной 200 мкм с помощью вибротома. Затем срезы переносят в камеры для тканей в 24-луночном планшете, где проводят их окрашивание и фиксацию. Заключительным этапом является нанесение срезов тканей на предметные стекла.

В конечном итоге конфокальная микроскопия используется для визуализации клеток, связанных с декстран-тримерами и антителами к CD4. Эта идея возникла у нас после того, как мы впервые продемонстрировали, что декстран-ER класса II MHC обладают более высокой чувствительностью по сравнению с традиционными тетрамерами MHC класса II при выявлении антигенспецифических аутореактивных CD4 T-клеток. Как правило, специалистам, которые только начинают осваивать данный метод, может быть трудно, поскольку нарезка и работа со свежими тканями представляют собой довольно сложную задачу.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы изготовления срезов, их монтирования и анализа трудно освоить из-за их сложности. Помимо Тин, два постдокторанта-исследователя из моей группы, Чанди и Аарон, а также Кристиан из лаборатории доктора Зои продемонстрируют эту процедуру. После эвтаназии мышей с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (EAE) удалите кости черепа, вырезая их по кругу изогнутыми ножницами, и аккуратно поднимите их пинцетом. Извлеките головной мозг методом тупой диссекции с помощью чистого скальпеля.

Отделите rerum от мозжечка. Поместите rerum в пробирку с холодным 1 x фосфатно-солевым буфером (PBS) и оставьте пробирку на льду до начала обработки. Поместите rerum в одноразовую гистологическую кассету с глубоким дном, которую следует содержать на льду.

Затем залейте в кассету расплавленный низкотемпературный арос в 4% PBS буфере. Сразу же осторожно прижмите большой мозг пинцетом, чтобы полностью погрузить ткань, и оставьте кассету на льду до полного затвердевания. После затвердевания обрежьте излишки ароса со всех сторон вокруг включенной ткани и слегка обнажите вентральную поверхность мозга.

Затем нанесите суперклей на блок ткани Vibram и перенесите ткань, имбедированную в Aros, на заклеенную поверхность, приложив открытую вентральную поверхность церебро к клею для последующего поперечного секционирования. После фиксации ткани на блоке не перемещайте ее. Поместите блок Vibram с имбедированной в Aros тканью на лед и дайте клею высохнуть в течение 15 минут.

Тем временем поместите подготовленные тканевые камеры в 24-луночный планшет из расчета одна камера на лунку. Заполните лунки с тканевыми камерами одним миллилитром холодного 1X PBS и оставьте планшет на льду. После высыхания клея опустите вибролезвие до уровня верхней поверхности ткани.

Установите скорость вибратома на 0,22 millimeters per second и начните серию срезов с движением вперед, чтобы получить срезы толщиной 200 micrometer. С помощью мягкой акварельной кисти перенесите по одному срезу головного мозга в каждую лунку с тканью. Держите 24-луночный планшет на льду до завершения процесса секционирования, чтобы предотвратить деградацию ткани.

Затем подготовьте второй 24-луночный планшет, добавив 300 µL коктейля, содержащего IA of S myelin protio lipid protein 1 39 to 1 51 dextro и антитела к CD4, в три лунки. Затем добавьте 300 µL контрольного коктейля, содержащего IA of S Tyler's murine encephalomyelitis virus 70 to 86 dextro и антитела к CD4, в другую группу из трех лунок. После этого промаркируйте лунки.

Затем перенесите три камеры с тканями, содержащие срезы, предназначенные для окрашивания специфическими dex trimmers, в три соответствующие лунки 24-луночного планшета из расчета одна камера на лунку. Аналогичным образом перенесите три камеры с тканями, содержащие срезы, предназначенные для окрашивания контрольными dex streamers, в соответствующие лунки. При размещении по одной камере в лунке накройте планшет крышкой.

Оберните планшет алюминиевой фольгой и поместите его на шейкер с gentle rotation на 1,5 часа в темноте при комнатной температуре. После инкубации промойте срезы ткани, перенеся их в чистую лунку с 1 mL холодного раствора one XPBS для промывки минимум на 10 минут на шейкере. Повторите процедуру промывки трижды.

Следите за тем, чтобы срезы ткани не пересыхали, так как они могут прилипнуть к стенкам камеры. Зафиксируйте срезы, перенеся камеры с тканью в новую лунку планшета на 24 лунки, содержащую один миллилитр фильтрованного 4%PBS буферизированного параформальдегида, и инкубируйте на платформе-качалке в течение двух часов при медленном вращении.

После еще трехкратной промывки перенесите окрашенные и фиксированные срезы на чистый предметное стекло. С помощью мягкой акварельной кисти удалите излишки воды, не касаясь среза, и зафиксируйте срез, используя среду для заключения. Накройте предметное стекло покровным стеклом и оставьте слайды сохнуть при комнатной температуре на ночь.

В темной комнате используйте систему конфокального микроскопа Nikon A1 Eclipse 90i для рутинного сканирования и получения изображений. Для начала откройте программное обеспечение NIS-Elements AR, выберите в панели каналы тетраэтилдиамина, руминизотиоцианата или TRITC и Cyanine 5 или Cy5. Длины волн возбуждения и эмиссии для каналов TRITC и Cy5 установлены по умолчанию.

Назначьте псевдоцвет зеленый для канала Trit Sea и красный для канала SCI five. Поместите исследуемый препарат на предметный столик микроскопа и сфокусируйтесь вручную при 100-кратном увеличении. Установите HV на 10 и смещение (offset) на ноль, нажмите кнопку фокусировки и отрегулируйте напряжение.

Для оптимизации лазеров нажмите focus scan, просканируйте срез сверху вниз и установите уровень Z для получения изображения. Затем нажмите CH series и последовательно получите изображения. Идентифицируйте dextro или положительные CD4-положительные Т-клетки, которые выглядят как желтые пунктирные клетки на основании колокализации сигналов, генерируемых как красным, так и зеленым каналами.

Для количественного подсчета CD4-положительных T-клеток используйте конфокальный микроскоп Olympus FV 500 BX 60. Для начала запустите программное обеспечение flu ovu. Выберите красители S SI three и SCI five из выпадающего меню и нажмите apply, чтобы активировать соответствующие лазеры.

Поместите исследуемый препарат на предметный столик микроскопа и вручную сфокусируйте его при малом увеличении; нажмите «focus» при включенном лазере SI three и сфокусируйтесь на очаге воспаления. Замените объектив на 100-кратный. В выпадающем меню установите размер файла 512 x 512, нажмите «focus» и отрегулируйте значения усиления (gain) и смещения (offset) ФЭУ для раздельной оптимизации лазеров SI three и sci five; нажмите «Z stage», а затем нажмите «focus» при включении обоих лазеров.

Установите высоту Z-столика, нажимая стрелки вверх и вниз. Установите Z-интервал на 2 µm. Нажмите «стоп» и подтвердите выбор.

Выполните поиск по осям 1, 2, 3. Затем нажмите X, y, Z и начните получение серии Z-стеков для выбранной области внутри очага воспаления, сохранив полученные Z-серийные изображения в виде файлов VI. Чтобы сохранить файлы изображений, выберите нужное изображение из Z-серии и сохраните его в формате TIFF.

Всегда сохраняйте многослойные изображения в формате TIFF. Сначала необходимо защитить данные, а следующим шагом будет изучение трех парных срезов, окрашенных обоими наборами декстримеров. Сначала сделайте серию Z-стеков, сканируя стекла горизонтально-вертикальными движениями вверх и вниз, чтобы избежать повторения Z-серий в одной и той же плоскости фокусировки.

После получения Z-серийных изображений присвойте файлам имена, указав номера предметных стекол, названия срезов и количество сделанных Z-серийных снимков. Используйте программное обеспечение ImageJ для подсчета dextro-положительных CD4-положительных T-клеток относительно общего числа CD4-положительных T-клеток. Выберите тип счетчика в ImageJ, установите флажок «show all» и начните подсчет, кликая в центр каждой клетки и переходя к подсчету на следующих Z-серийных изображениях с помощью боковых стрелок.

После подсчета всех CD4+ T-клеток выберите другой тип счетчика и подсчитайте декстран-положительные CD4+ T-клетки. Перейдите на вкладку результатов, чтобы получить общее количество клеток, подсчитанных с помощью двух разных счетчиков. Детекция CD4+ T-клеток, специфичных к миелиновому олигодендроцитарному гликопротеину или PLP, проводилась с использованием свежесрезанных срезов головного мозга мышей с ЭАЭ, окрашенных коктейлями, содержащими анти-CD4 и декстраны PLP 139–151 или контрольные декстраны TMEV 70–86, с помощью LSCM.

Анализ срезов головного мозга при совместном окрашивании выявил клетки, положительные по декстримерам PLP 1 39–1 51 (красный цвет), и клетки, положительные по антителам к CD4 (зеленый цвет), в то время как дважды положительные клетки выглядели желтыми. В совместно окрашенных клетках наблюдались точечные включения по периферии. Такая особенность отсутствовала в срезе, окрашенном с помощью контрольного TMEV 70–86.

Для обнаружения CD4+ Т-клеток, специфичных к сердечному миозину, было проведено окрашивание in situ с использованием декстеров к тяжелой цепи альфа-3 сердечного миозина 3 34-3 52. Анализ этих изображений с помощью LSCM выявил наличие клеток, положительных по MYHC 3 34-3 52 декстерам (красный цвет), клеток, положительных по CD4 (зеленый цвет), и клеток, связанных и с декстером, и с CD4 (желтые точечные клетки). Фоновое окрашивание для контрольных РНК 43-56 декстеров было незначительным. При правильном выполнении эта методика занимает около 8–10 часов, в отличие от трех дней, предусмотренных другими опубликованными протоколами.

При выполнении данной процедуры важно не забывать заранее подготовить реагенты и систематически следовать всем этапам. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить секционирование и окрашивание тканей для подсчета CD4+ T-клеток в целевых органах.