Быстрое Выделение и очистка митохондрий Для трансплантации тканью диссоциации и дифференциальной фильтрации
6 сентября 2014 г.
Способ быстрого выделения митохондрий из млекопитающих биопсии тканей описан. Печень крысы или скелетные мышечные препараты гомогенизировали с коммерческой диссоциатора ткани и митохондрии были изолированы с помощью дифференциальной фильтрацией через нейлоновое сито фильтров. Митохондриальная время изоляция <30 мин по сравнению с 60 - 100 мин с использованием альтернативных методов.
Общая цель данной процедуры заключается в быстром выделении чистых и функционально активных с точки зрения дыхания митохондрий из тканей крысы. Это достигается путем предварительного объединения и гомогенизации образцов тканей. На следующих этапах в гомогенат добавляют субин А с последующим инкубированием на льду.
Затем гомогенат смешивают с BSA и фильтруют, после чего процедуру фильтрации повторяют. Заключительные этапы включают центрифугирование фильтрата и ресуспендирование осадка митохондрий в дыхательном буфере. В конечном итоге, жизнеспособность и дыхательная активность изолированных митохондрий могут быть подтверждены с помощью анализа дыхания и люминесцентного анализа на АТФ.
Основным преимуществом данной методики перед существующими способами, время выделения митохондрий при которых составляет от 60 до 100 минут, является возможность получения жизнеспособных митохондрий с сохраненной способностью к дыханию менее чем за 30 минут. Эллисон Маккей, технический специалист из сотрудничающей лаборатории, продемонстрирует проведение анализа АТФ-люминесценции. Непосредственно перед началом работы растворите сукцинат в 1 мл гомогенизирующего буфера, а также растворите BSA в 1 мл гомогенизирующего буфера.
Начните со сбора двух свежих образцов ткани с помощью биопсийного панча диаметром 6 мм, затем поместите их в XPBS на льду в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Когда будете готовы, перенесите ткань в пробирку для диссоциации, содержащую 5 мл ледяного гомогенизирующего буфера. Затем гомогенизируйте ткань, установив пробирку в устройство для диссоциации тканей и выбрав предустановленный цикл изоляции митохондрий.
По завершении верните пробирку на лед и добавьте 250 µL стокового раствора субтилизина. Перемешайте содержимое путем инверсии. Когда смесь станет однородной, инкубируйте гомогенат на льду в течение 10 минут.
Затем установите фильтр с размером пор 40 микрон на коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл и поместите ее в лед. Увлажните фильтр гомогенизирующим буфером и слейте буфер в контейнер для отходов. После того как все будет готово, профильтруйте гомогенат.
Добавьте 250 µL стокового раствора BSA и перемешайте путем инверсии. Однако этот этап следует пропустить при анализе митохондриальных белков. Теперь подготовьте еще две пробы.
Конические центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров помещают на лед, одну из них оснащая фильтром 40 мкм, а другую — фильтром 10 мкм. Оба фильтра предварительно смачивают небольшим количеством гомогенизирующего буфера, после чего буфер сливают. Затем гомогенат пропускают сначала через фильтр 40 мкм, а затем через фильтр 10 мкм.
Эти этапы фильтрации значительно повышают чистоту митохондрий. Теперь разделите фильтрат между двумя предварительно охлажденными микроцентрифужными пробирками объемом 1.5 мл и центрифугируйте их при 9, 000 G в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Затем удалите супернатант, ресуспендируйте и объедините два очищенных митохондриальных осадка.
В одном миллилитре ледяного дыхательного буфера; крайне важно, чтобы вся процедура проводилась при температуре 4 °C. Теперь можно провести анализ очищенных митохондрий для определения метаболической активности изолированных митохондрий. Анализ люминесценции АТФ можно выполнить с использованием набора для анализа АТФ.
Сначала доведите реагенты набора до комнатной температуры. Затем приготовьте стоковый раствор HT P и поместите его на лед. Следующим шагом добавьте пять миллилитров буфера для субстрата к лиофилизированному раствору субстрата.
Осторожно перемешайте и поместите в темное место. Затем добавьте по 100 µL дыхательного буфера в каждую лунку непрозрачной черной планшеты на 96 лунок. Добавьте по 10 µL подготовленных митохондрий в лунки под стандартами А TP.
Каждый уникальный образец митохондрий следует наносить в трех повторностях; три лунки заполните только дыхательным буфером в качестве отрицательного контроля. Затем добавьте по 50 µL раствора для лизиса клеток млекопитающих в каждую заполненную лунку. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение пяти минут на орбитальном шейкере при 120 RPM.
Во время инкубации подготовьте разведения стандарта A TP в диапазоне от 1/10 мМ до 1/10 мкМ. После завершения инкубации добавьте по 10 µL каждого стандарта A TP в соответствующие лунки, указанные на схеме планшета. Затем добавьте в каждую лунку по 50 µL реконструированного раствора субстрата.
Затем снова инкубируйте планшет в течение пяти минут, как и ранее. Перейдите к анализу планшетов на планшетном ридере. Откройте программное обеспечение в разделе.
Создайте новый элемент. Нажмите на «эксперимент». Затем нажмите на «протокол по умолчанию» и нажмите «ОК».
В левой колонке выберите protocol. Затем procedure. После этого выберите delay и установите значение 10 minutes. Затем подтвердите ввод, нажав okay.
Теперь выберите, прочитайте и выберите «люминесценция» (luminescence) в выпадающем меню. Настройте остальные параметры следующим образом: тип считывания — конечная точка (endpoint), время интеграции.
Одна секунда. Наборы фильтров устанавливают положение оптики одного отверстия эмиссии, верхняя чувствительность 100, вертикальное смещение верхнего зонда один миллиметр. После внесения этих изменений нажмите «ОК».
Нажмите на схему планшета и настройте её соответствующим образом. Нажмите «ОК». Теперь, когда все параметры установлены, нажмите значок чтения планшета в верхнем ряду и нажмите «Read» (Читать).
После открытия спектрофотометра поместите планшет в лоток так, чтобы лунка A1 находилась в верхнем левом углу. Затем откроется окно с отображением температуры; нажмите «ОК» и перейдите к анализу данных. Образцы скелетных мышц массой около 0.18 г (влажный вес) содержали около 24 миллиардов митохондрий, согласно данным подсчета частиц по размеру.
Образцы печени одинакового размера дали на несколько миллиардов больше. Показания гемоцитометра при подсчете митохондрий были занижены по сравнению с данными счетчика частиц. Была получена репрезентативная кривая, показывающая, что изолированные митохондрии сосредоточены под одним пиком со средним диаметром около четырех десятых микрона.
Это согласуется с предыдущими отчетами с использованием анализа на би-кислоты. Содержание митохондриального белка в скелетных мышцах и печени составило несколько миллиграммов на грамм ткани. Полученный продукт был жизнеспособным и сохранял способность к дыханию.
Митохондрии были выделены в интервале времени, совместимом с клиническим и хирургическим терапевтическим вмешательством. Электронные микрофотографии показали, что все выделенные митохондрии были электронно-плотными, при этом повреждения наблюдались менее чем у одного из 10 000 органелл, а уровень загрязнения составлял менее одного на сто тысяч. Результаты анализа АТФ показали, что митохондрии были жизнеспособны, а содержание АТФ составляло примерно 11 или 15 нмоль на мг митохондриального белка.
Анализ митохондриального дыхания был проведен с использованием электрода типа Кларка, который показал, что потребление кислорода составляло около 180 нмоль кислорода в минуту на каждый миллиграмм митохондриального белка, при этом значения RCI составили около 2,5, с немного более высоким показателем для печени. После освоения этой методики ее выполнение занимает менее 30 минут при правильном соблюдении протокола.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается экспресс-метод выделения чистых и функционально активных по дыханию митохондрий из биоптатов тканей крысы. Данная процедура позволяет существенно сократить время выделения — менее 30 минут по сравнению с традиционными методами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследования митохондрий
Обзор
- Митохондрии необходимы для клеточного дыхания и выработки энергии.
- Традиционные методы выделения митохондрий могут быть трудоемкими и занимать много времени.
- Методы быстрого выделения позволяют повысить эффективность экспериментов.
- Жизнеспособные митохондрии имеют решающее значение для точности метаболических исследований.
Цель исследования
- Разработка более быстрого метода выделения митохондрий из тканей млекопитающих.
- Обеспечение чистоты и функциональной активности выделенных митохондрий.
- Облегчение последующего анализа дыхания и проведения анализов на АТФ.
Используемые методы
- Гомогенизация образцов печени или скелетных мышц крысы.
- Использование коммерческого диссоциатора тканей для эффективного перемешивания.
- Последовательная фильтрация через нейлоновые сетчатые фильтры.
- Ресуспендирование митохондриальных осадков в дыхательном буфере.
Основные результаты
- Время выделения сокращено до менее чем 30 минут.
- Выделенные митохондрии продемонстрировали жизнеспособность и дыхательную активность.
- Результаты подтверждены с помощью анализа дыхания и люминесцентного анализа АТФ.
- Метод обладает потенциалом для более широкого применения в метаболических исследованиях.
Выводы
- Метод быстрого выделения эффективен для получения функциональных митохондрий.
- Данная методика позволяет оптимизировать исследовательские процессы при изучении митохондрий.
- В будущих исследованиях может быть изучена возможность её применения для различных тканей млекопитающих.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Быстрая изоляция митохондрий менее чем за 30 минут позволяет своевременно проводить функциональную оценку для доклинических метаболических исследований и терапевтического скрининга. Данный метод способствует валидации мишеней, обеспечивая получение функционально активных митохондрий из биоптатов тканей, что снижает биологическую вариабельность на ранних этапах поиска. Стандартизированный рабочий процесс диссоциации и фильтрации тканей повышает воспроизводимость результатов в разных лабораториях, способствуя получению согласованных данных для принятия решений о продолжении или прекращении программ, направленных на митохондрии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное открытие и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функцию митохондрий как терапевтическую мишень в моделях метаболических заболеваний.
- Практическая ценность: заменяет ручную гомогенизацию стандартизированной диссоциацией тканей для единообразного приготовления образцов.
- Прогностическая ценность: позволяет получать жизнеспособные митохондрии для анализов дыхания и уровня ATP, что способствует механистическому снижению рисков при оценке ведущих соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение очищенных митохондрий, подходящих для высокопроизводительных анализов дыхания и люминесцентных тестов.
- Практическая ценность: исключает повторяющиеся этапы центрифугирования за счет дифференциальной фильтрации, что повышает пропускную способность.
- Готовность к анализу: обеспечивает стабильный выход митохондрий (~2x10^10 на 0.18g ткани) для достоверного скрининга соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Сохраняет целостность митохондрий и их способность к дыханию, что критически важно для тестирования предварительной эффективности.
- Практическая ценность: Совместим с клиническими временными рамками, что позволяет проводить выделение в интервалах хирургического вмешательства.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает согласованность биомаркеров через показатели содержания ATP и потребления кислорода.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Этот метод вписывается в континуум открытий — от ранней валидации мишени до доклинической оценки митохондрий, предлагая быстрый и воспроизводимый этап перед скринингом соединений или исследованиями эффективности.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез о митохондриальной дисфункции в моделях заболеваний с помощью функциональных показателей.
- Скрининг: Позволяет получать готовые для анализа препараты митохондрий с повышенной чистотой за счет последовательной фильтрации через фильтры 40µm и 10µm.
- Аналитика: Предоставляет количественные данные для анализа дыхания (потребления кислорода) и люминесценции ATP, что облегчает сравнение условий.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает связь с доклинической валидацией за счет получения дыхательно-компетентных митохондрий, пригодных для тестирования ex vivo.
- Корпоративное использование: Стандартизированный протокол с использованием коммерческого диссоциатора тканей позволяет внедрять метод в разных лабораториях и интегрировать его в рабочие процессы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая достоверность взаимодействия с митохондриальной мишенью посредством валидированных анализов дыхания и синтеза АТФ.
- Операционная ценность: Сокращение времени выделения (<30 мин) и исключение этапов градиентного центрифугирования повышают эффективность работы лаборатории.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более быстрые итерации при идентификации перспективных соединений-лидеров за счет своевременного получения данных о функциональном состоянии митохондрий.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков путем снижения количества ложноположительных результатов при скрининге митохондриальных мишеней.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с тканями и методами анализа митохондрий.
- Необходим доступ к коммерческому диссоциатору тканей с предустановленным циклом выделения митохондрий.
- Требуются стерильные нейлоновые сетчатые фильтры (40µm и 10µm) и центрифугирование с контролем температуры (4°C, 9,000 x g).
- Стандартизация для различных типов тканей (например, скелетных мышц, печени) может потребовать оптимизации параметров диссоциации.
- Практическое ограничение: метод валидирован на тканях крыс; экстраполяция на ткани человека или других млекопитающих требует дополнительной валидации.
