Быстрое Выделение и очистка митохондрий Для трансплантации тканью диссоциации и дифференциальной фильтрации
6 сентября 2014 г.
Способ быстрого выделения митохондрий из млекопитающих биопсии тканей описан. Печень крысы или скелетные мышечные препараты гомогенизировали с коммерческой диссоциатора ткани и митохондрии были изолированы с помощью дифференциальной фильтрацией через нейлоновое сито фильтров. Митохондриальная время изоляция <30 мин по сравнению с 60 - 100 мин с использованием альтернативных методов.
Общая цель этой процедуры заключается в быстрой изоляции чистых и пригодных к дыханию митохондрий из тканей крыс. Это достигается путем первичной ассоциации и гомогенизации образцов тканей. Следующие шаги заключаются в смешивании субина А с гомогенатом и инкубации на льду.
Затем следует фильтрация гомогената в BSA и его повторная фильтрация. Заключительными шагами являются замедление фильтрата и ресуспендирование митохондриальных гранул в дыхательном буфере. В конечном счете, результаты могут показать, что изолированные митохондрии жизнеспособны и способны к дыханию, благодаря анализу дыхания и анализу люминесценции A TP.
Основное преимущество этого метода перед существующими методами, которые сообщают о времени выделения митохондрий в диапазоне от 60 до ста минут, заключается в том, что жизнеспособные и компетентные в дыхании митохондрии могут быть изолированы менее чем за 30 минут. Эллисон Маккей, техник из сотрудничающей лаборатории, продемонстрирует люминесцентный анализ A TP непосредственно перед началом. Растворите субин А в одном миллилитре гомогенизирующего буфера и растворите БСА также в одном миллилитре гомогенизирующего буфера.
Теперь начните со сбора двух свежих образцов тканей с помощью шестимиллиметрового пуансона для биопсии и храните их в одном XPBS на льду в 50-литровой центрифужной пробирке. Когда все будет готово, переложите ткань в диссоциативную С-трубку, содержащую пять миллилитров ледяного гомогенизирующего буфера. Затем гомогенизируйте ткань, подогнав трубку к месту диссоциации ткани и выбрав заданный цикл выделения митохондрий.
Когда закончите, поставьте тюбик обратно на лед и добавьте 250 микролитров субмарины в исходный раствор. Перемешайте это с помощью инверсии. Когда смесь выглядит равномерно распределенной, инкубируйте гомогенат на льду в течение 10 минут.
Затем поместите сетчатый фильтр 40 микрон на коническую центрифужную трубку объемом 50 миллилитров и упакуйте его в лед. Смочите фильтр гомогенизирующим буфером и выбросьте буфер в контейнер для отходов. Затем, когда все будет готово, вылейте гомогенат через фильтрат.
Добавьте 250 микролитров исходного раствора БСА и перемешайте путем инверсии. Однако этот шаг следует пропустить для анализа митохондриальных белков. Теперь приготовьте еще два.
На 50 миллилитровых конических центрифужных пробирках на льду помещается одна с фильтром 40 микрон, а другая с фильтром 10 микрон. Намочите оба фильтра небольшим количеством гомогенизирующего буфера и выбросьте этот буфер. Затем вылейте гомогенат сначала через фильтр 40 микрон, а затем через фильтр 10 микрон.
Эти этапы фильтрации значительно улучшают чистоту митохондрий. Теперь разделите фильтрат между двумя предварительно охлажденными 1,5-миллилитровыми микропробирками и центрифугируйте их при 9 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте и соедините две очищенные митохондриальные гранулы.
В одном миллилитре буфера для холодного дыхания жизненно важно, чтобы вся процедура проводилась при температуре четыре градуса Цельсия. Очищенные митохондрии теперь могут быть протестированы для определения метаболической активности изолированных митохондрий. Люминесцентный анализ A TP может быть выполнен с помощью набора для анализа A TP.
Для начала доведите набор реагентов до комнатной температуры. Далее приготовьте исходный раствор HT P и поместите его на лед. Следующим шагом является добавление пяти миллилитров субстратного буфера в лиофилизированный раствор субстрата.
Аккуратно перемешайте и поставьте в темноту. Затем добавьте 100 микролитров дыхательного буфера в каждую лунку 96-луночной пластины, которая имеет непрозрачный черный цвет. Добавьте 10 микролитров подготовленных митохондрий в лунки ниже нормы А ТП.
Каждый уникальный митохондриальный образец должен быть помещен в тройную пластину с тремя лунками только дыхательного буфера в качестве отрицательного контроля. Продолжайте добавлять 50 микролитров раствора для лизиса клеток млекопитающих в каждую лунку после загрузки. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут на орбитальном вибростенде со скоростью 120 оборотов в минуту.
Во время инкубации приготовьте разведения стандарта A TP в диапазоне от одного 10-го миллимоляра до одного 10-го микромоляра. После инкубации добавьте по 10 микролитров каждого из стандартов А ТП в соответствующие лунки, указанные на карте планшета. Далее добавьте в каждый по 50 микролитров восстановленного раствора субстрата.
Ну а затем снова инкубируйте тарелку, как и раньше, в течение пяти минут. Продолжайте осмотр пластин на считывателе пластин. Откройте программное обеспечение ниже.
Создайте новый элемент. Нажмите на эксперимент. Затем нажмите на протокол по умолчанию и нажмите OK.
В левом столбце выберите Протокол. Затем выберите задержку и установите ее на 10 минут. Тогда ладно, вход.
Теперь выберите, прочитайте и выберите люминесценцию из выпадающего меню. Отрегулируйте остальные настройки следующим образом. Время интеграции конечной точки типа чтения.
Секунду. Фильтр устанавливает положение оптики одного эмиссионного отверстия, верхнюю чувствительность 100, вертикальное смещение верхнего зонда один миллиметр. После внесения этих изменений нажмите кнопку ОК.
Нажмите на раскладку табличек и настройте ее соответствующим образом. Нажмите OK. Теперь, когда все готово, нажмите на значок таблички для чтения в верхнем ряду и нажмите «Прочитать».
Когда спектрофотометр откроется, поместите пластину в лоток с лункой А в верхнем левом углу. Теперь откроется окно с отображением температуры, нажмите ОК, затем продолжите анализ данных. Образцы скелетных мышц весом около 0,18 грамма во влажном состоянии дали около 24 миллиардов митохондрий на основе подсчета размеров частиц.
Образцы печени такого же размера дали еще несколько миллиардов. Показания митохондриального гемоцитометра были занижены с помощью счетчика частиц. Была получена репрезентативная трассировка, которая показывает, что изолированные митохондрии локализуются под одним пиком со средним диаметром около четырех десятых микрона.
Это согласуется с предыдущими отчетами с использованием бикислотного анализа. Митохондриальный белок был измерен в нескольких миллиграммах на грамм ткани скелетных мышц и печени. Продукт был жизнеспособным и пригодным для дыхания.
Митохондрии изолированы в сроки, совместимые с клиническим и хирургическим терапевтическим вмешательством. Просвечивающие электронные микрофотографии показали, что все изолированные митохондрии представляют собой электронные вмятины с повреждением менее чем в одной из 10 000, загрязнение было менее чем в одной из ста тысяч A TP анализа. Результаты показали, что митохондрии жизнеспособны, а содержание TP составляет около 11 или 15 наномолей на миллиграмм митохондриального белка.
Анализ митохондриального дыхания был проведен с использованием электрода типа Кларка и показал, что потребление кислорода составляет около 180 MLE кислорода в минуту. Для каждого миллиграмм митохондриального белка, в то время как значения RCI составляли около 2,5 с немного более высоким показателем печени После освоения эта техника может быть выполнена менее чем за 30 минут, если она выполнена правильно.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается экспресс-метод выделения чистых и функционально активных по дыханию митохондрий из биоптатов тканей крысы. Данная процедура позволяет существенно сократить время выделения — менее 30 минут по сравнению с традиционными методами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследования митохондрий
Обзор
- Митохондрии необходимы для клеточного дыхания и выработки энергии.
- Традиционные методы выделения митохондрий могут быть трудоемкими и занимать много времени.
- Методы быстрого выделения позволяют повысить эффективность экспериментов.
- Жизнеспособные митохондрии имеют решающее значение для точности метаболических исследований.
Цель исследования
- Разработка более быстрого метода выделения митохондрий из тканей млекопитающих.
- Обеспечение чистоты и функциональной активности выделенных митохондрий.
- Облегчение последующего анализа дыхания и проведения анализов на АТФ.
Используемые методы
- Гомогенизация образцов печени или скелетных мышц крысы.
- Использование коммерческого диссоциатора тканей для эффективного перемешивания.
- Последовательная фильтрация через нейлоновые сетчатые фильтры.
- Ресуспендирование митохондриальных осадков в дыхательном буфере.
Основные результаты
- Время выделения сокращено до менее чем 30 минут.
- Выделенные митохондрии продемонстрировали жизнеспособность и дыхательную активность.
- Результаты подтверждены с помощью анализа дыхания и люминесцентного анализа АТФ.
- Метод обладает потенциалом для более широкого применения в метаболических исследованиях.
Выводы
- Метод быстрого выделения эффективен для получения функциональных митохондрий.
- Данная методика позволяет оптимизировать исследовательские процессы при изучении митохондрий.
- В будущих исследованиях может быть изучена возможность её применения для различных тканей млекопитающих.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Быстрая изоляция митохондрий менее чем за 30 минут позволяет своевременно проводить функциональную оценку для доклинических метаболических исследований и терапевтического скрининга. Данный метод способствует валидации мишеней, обеспечивая получение функционально активных митохондрий из биоптатов тканей, что снижает биологическую вариабельность на ранних этапах поиска. Стандартизированный рабочий процесс диссоциации и фильтрации тканей повышает воспроизводимость результатов в разных лабораториях, способствуя получению согласованных данных для принятия решений о продолжении или прекращении программ, направленных на митохондрии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное открытие и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функцию митохондрий как терапевтическую мишень в моделях метаболических заболеваний.
- Практическая ценность: заменяет ручную гомогенизацию стандартизированной диссоциацией тканей для единообразного приготовления образцов.
- Прогностическая ценность: позволяет получать жизнеспособные митохондрии для анализов дыхания и уровня ATP, что способствует механистическому снижению рисков при оценке ведущих соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение очищенных митохондрий, подходящих для высокопроизводительных анализов дыхания и люминесцентных тестов.
- Практическая ценность: исключает повторяющиеся этапы центрифугирования за счет дифференциальной фильтрации, что повышает пропускную способность.
- Готовность к анализу: обеспечивает стабильный выход митохондрий (~2x10^10 на 0.18g ткани) для достоверного скрининга соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Сохраняет целостность митохондрий и их способность к дыханию, что критически важно для тестирования предварительной эффективности.
- Практическая ценность: Совместим с клиническими временными рамками, что позволяет проводить выделение в интервалах хирургического вмешательства.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает согласованность биомаркеров через показатели содержания ATP и потребления кислорода.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Этот метод вписывается в континуум открытий — от ранней валидации мишени до доклинической оценки митохондрий, предлагая быстрый и воспроизводимый этап перед скринингом соединений или исследованиями эффективности.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез о митохондриальной дисфункции в моделях заболеваний с помощью функциональных показателей.
- Скрининг: Позволяет получать готовые для анализа препараты митохондрий с повышенной чистотой за счет последовательной фильтрации через фильтры 40µm и 10µm.
- Аналитика: Предоставляет количественные данные для анализа дыхания (потребления кислорода) и люминесценции ATP, что облегчает сравнение условий.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает связь с доклинической валидацией за счет получения дыхательно-компетентных митохондрий, пригодных для тестирования ex vivo.
- Корпоративное использование: Стандартизированный протокол с использованием коммерческого диссоциатора тканей позволяет внедрять метод в разных лабораториях и интегрировать его в рабочие процессы.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая достоверность взаимодействия с митохондриальной мишенью посредством валидированных анализов дыхания и синтеза АТФ.
- Операционная ценность: Сокращение времени выделения (<30 мин) и исключение этапов градиентного центрифугирования повышают эффективность работы лаборатории.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более быстрые итерации при идентификации перспективных соединений-лидеров за счет своевременного получения данных о функциональном состоянии митохондрий.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков путем снижения количества ложноположительных результатов при скрининге митохондриальных мишеней.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с тканями и методами анализа митохондрий.
- Необходим доступ к коммерческому диссоциатору тканей с предустановленным циклом выделения митохондрий.
- Требуются стерильные нейлоновые сетчатые фильтры (40µm и 10µm) и центрифугирование с контролем температуры (4°C, 9,000 x g).
- Стандартизация для различных типов тканей (например, скелетных мышц, печени) может потребовать оптимизации параметров диссоциации.
- Практическое ограничение: метод валидирован на тканях крыс; экстраполяция на ткани человека или других млекопитающих требует дополнительной валидации.
