В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Общая цель этой процедуры заключается в получении 3D-стеков с высоким разрешением, содержащих гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки, и их мониторинге с течением времени с помощью многоточечной покадровой визуализации. Это достигается путем предварительного мечения гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток или ГСК липофильным красителем. Затем ГСК вводятся в мышь-реципиент.

Мышь подготавливается к микроскопии с помощью специального головного передатчика и держателя образца для стабильного позиционирования животного. Затем получают стеки гемопоэтических стволовых и прогениторных клеточных ниш с высоким разрешением, а также проводят покадровую визуализацию множественных участков костного мозга, содержащих ФК HS, в конечном итоге внутрижизненно важную конфокальную и используют двухфотонную микроскопию, чтобы показать локализацию и перемещение ГСК в пространстве костного мозга. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как иммунофлюоресценция на срезах костного мозга, заключается в том, что мы можем захватывать информацию в четырехмерном масштабе, в трех измерениях плюс время.

Применение этого метода распространяется и на терапию гематологических заболеваний, поскольку он помогает понять, куда нам нужно направить гемопоэтические стволовые клетки в костном мозге, чтобы гарантировать их правильное функционирование. Впервые у нас появилась идея этого метода, когда мы поняли, насколько важно в первую очередь иметь возможность следить за HS PC с течением времени. Этот метод помогает нам ответить на любые вопросы, которые у нас возникают в области ниши стволовых клеток, где мы хотим знать, где находятся стволовые клетки и как они ведут себя с течением времени.

Для начала сбор гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток, как было продемонстрировано этой лабораторией в предыдущем видео на сайте и указано в текстовом протоколе. Далее добавьте в клеточную суспензию липофильный краситель DID в конечной концентрации пять микромоляров. Немедленно внесите вихревую суспензию, чтобы гарантировать, что краситель не выпадет в осадок из раствора и не пометит клетки.

Инкубируйте клетки в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы промыть клетки. Сначала вращайте при 500-кратном G в течение пяти минут и сцеживайте жидкость. Затем ресуспендируют клетки в 200 микролитрах PBS и соберут в инсулиновый шприц.

Инсулиновый шприц рекомендуется использовать вместо обычного, потому что в нем нет мертвого пространства иглы. Позволяя вводить мышке всю клеточную суспензию для введения клеток в смертельную фазу, я облучал мышь через инъекцию в хвостовую вену. Сначала поместите мышь в теплую камеру.

Как только появится хвостовая вена, расширившаяся от сосудов, переместите мышь в ограничитель. Осторожно проведите иглой в хвостовую вену. Введите клетки в вену.

Не должно быть никакого сопротивления инъекциям. Оставьте мышь на ночь. Чтобы позволить клеткам мигрировать в пространство костного мозга, сделайте мышь анестезией и следите за наступлением глубокой анестезии с помощью лепесткового рефлекса.

Промокните верхнюю часть кожи головы 70% этанолом на салфетку. Будьте осторожны, чтобы этанол не попал в глаза мыши. Чтобы обнажить область кальварии, которую необходимо изобразить, сделайте небольшой разрез на затылке между ушами, приподнимая кожу вверх с помощью щипцов, удерживая кожу вверх.

Проведите ножницами под кожу и аккуратно разрежьте по внешней стороне желаемой области визуализации. Протрите обнаженную кость стерильной ватной палочкой, смоченной в стерильном PBS, чтобы кость оставалась влажной. Это позволяет избежать чрезмерного высыхания и образования рубцов, которые могут повлиять на качество изображения.

Затем смешайте достаточное количество стоматологического цемента с сывороткой, пока она не превратится в пасту. Быстро нанесите его на нижнюю поверхность автоклава головного убора, который будет крепиться к черепу. Прежде чем цемент застынет, поместите головной убор на череп мыши, следя за тем, чтобы стоматологический цемент не попал на область визуализации, и подождите, пока он схватится.

Нанесите небольшое количество гидрогеля, который сохраняет череп влажным, стараясь не повредить цемент по мере его высыхания. Затем прикрепите головной передатчик к держателю и закрепите его на месте. С помощью винта следим за тем, чтобы пазы входили в выемки держателя.

Удалите гидрогель стерильными ватными палочками перед переносом в микроскоп. Далее вставьте держатель в предметный столик микроскопа и расположите нагревательный коврик под мышью. Вставьте щуп ректального термометра и закрепите все на месте на сцене с помощью скотча.

Нанесите небольшую каплю офтальмологической мази на глаза мыши, чтобы они не высохли, находясь под анестезией. Мышь нельзя оставлять без присмотра во время процесса визуализации, пока она находится под анестезией. Фокусироваться на черепе с помощью окуляров.

Сначала заполните окно визуализации кальварии очищенной стерильной водой с помощью линзы для погружения в воду. Опустите его так, чтобы он касался капли воды. Сфокусируйтесь на верхней части черепа с помощью окуляров микроскопа.

Расположите область визуализации на центральном шве и двигайтесь к задней части головы, чтобы найти корональный шов. В качестве исходной позиции поместите программное обеспечение в режим захвата изображений XY, а также стек из трех DZ. Установите скорость изображения на 400 герц и разрешение на 512 на 512 пикселей.

Настройте программное обеспечение таким образом, чтобы захватывать несколько каналов, и настройте метод сбора данных для изменения настроек между стеками или между кадрами. Настройте три независимых параметра захвата. Выключение лазерной подсветки в конце захвата каждого стека.

Затем настройте первое последовательное сканирование для двухфотонной генерации второй гармоники костного сигнала. Откройте затвор многофотонного лазера и убедитесь, что усиление и смещение многофотонного лазера настроены правильно. Кроме того, убедитесь, что мощность лазера составляет от 12,5 до 25% и лазер включен.

Выберите подходящий ФЭУ в качестве единственного детектора и измените цвет на белый. Повторите процедуру настройки канала для комбинированной автофлуоресценции и ДРИ при второй настройке. Отсканируйте с помощью двух подходящих p-mts.

Измените цвет канала на зеленый для автофлуоресценции и красный для DID. Наконец, настройте третье и последнее сканирование для обнаружения GFP. Установите мощность лазера 488-нанометровой лазерной линии на отметку 15%Выберите подходящий фотоумножитель или ФЭУ в качестве единственного активного детектора и измените его псевдоцвет на зеленый.

Активируйте режим изображения в реальном времени, чтобы начать предварительный просмотр выбранного канала и отрегулировать усиление и смещение детектора для оптимальной экспозиции. Повторяйте это для каждого сканирования в последовательном окне и сохраняйте настройки этих многоканальных сканирований для удобного повторного использования. Затем активируйте многопозиционный захват под названием «отметка и найдите» в этой программе и сбросьте координаты точек.

Затем просканируйте область визуализации кости, начиная с пересечения между центральным и корональным швами. Отсканируйте глубину области костного мозга с помощью автофлуоресценции и ДРИ с помощью композитного изображения. Когда ячейка будет обнаружена, отметьте ее как новую координатную позицию, щелкнув значок добавления новой позиции в левой части метки и окна.

После того как текущее поле зрения будет изучено, переместите рабочую область на расстояние одного поля зрения. Повторите этот процесс для каждого поля зрения. Постепенно прорабатываем вокруг всего окна снимка слева от центрального шва, двигаясь к носу мыши.

Как только разветвление центрального шва станет очевидным, перейдите на правую сторону шва и повторите процедуру. Сканируем левую сторону в обратном направлении. Отметьте координаты любых новых интересующих ячеек с помощью инструмента «Отметить и найти».

Чтобы просмотреть точки, установите верхнюю и нижнюю части стопки Zs вокруг каждой ячейки для каждой позиции. Для каждой точки сфокусируйтесь вверх и вниз и установите верхнюю и нижнюю Z-позиции для захвата трех стеков DZ. Обновите отдельную точку в метке и находке, установите интервал Зака на пять микрометров и усреднение для каждого канала последовательного сканирования до соответствующего качества.

Получите высококачественный эталонный стек для каждой точки интереса, начав всю процедуру сканирования. После завершения высококачественного сканирования активируйте настройку интервальной съемки для съемки и настройки интервальной съемки. Установите временной интервал равным пяти минутам, а общее время выполнения — нужной продолжительности.

Примените эти настройки к общему сканированию. В этом примере показано, как можно выполнить сбор данных по более чем трем точкам: изменяя эти параметры, можно сократить время сканирования до пятиминутного интервала за счет уменьшения количества сканирований, используемых для усреднения, ограничив разрешение до 512 на 512 пикселей. При преобразовании сканирования в двунаправленное и/или увеличении скорости сканирования до 600 Гц и более начните съемку, как и раньше, нажатием кнопки «Пуск» и продемонстрированным программным обеспечением.

После завершения визуализации выполните эвтаназию мышей, как описано в текстовом протоколе. Изготовленный на заказ высокоточный держатель мыши, включая окно для визуализации в виде кальварии, позволяет пролонгировать визуализацию меченых ПК HS, введенных мышам-реципиентам с летальным облучением. Здесь представлены 2D-срезы 3D-стеков HSPC с разрешением одной клетки, содержащие участки костного мозга толщиной примерно от 90 до 120 микрометров из коллагена. Кость показана белым цветом, меченые DID клетки показаны красным.

Аутофлуоресцентные клетки показаны желтым цветом, а остеобластические клетки — зеленым. Здесь показан 40-кратный видеоролик идентифицированных ПК HS, на котором A DID помечен красным цветом HSC, мигрирующий в непосредственной близости от остеобластических клеток зеленым цветом после освоения. Этот метод должен быть выполнен примерно за час для операции и первоначальной визуализации, за которой следует достаточное время для покадровой визуализации.

После просмотра этого видео вы должны быть вполне уверены в том, что сможете настроить визуализацию теленка мыши и посмотреть на несколько HS PC с течением времени.