Фундаментальный Технический Элементы замерзания перелома / Зафиксированные-травления в биологическом электронной микроскопии

Целью данного эксперимента является создание углеродно-платиновой реплики образца биологических или иных материалов для исследования методом просвечивающей электронной микроскопии. Для этого образцы, подготовленные в виде двойных и одинарных реплик, подвергаются ультрабыстрой заморозке для ограничения образования кристаллов льда. Затем замороженный образец подвергается разрушению путем дистанционного манипулирования при температурах жидкого азота в условиях высокого вакуума, что приводит к разрыву мембраны по липидному бислою с образованием внешней поверхности и поверхности, прилегающей к цитоплазматической стороне.

В качестве дополнительного необязательного этапа можно выявить скрытые структурные особенности, удалив воду с поверхности излома образца путем перемещения рычага охлаждающего микротома над предметным столиком для создания температурного градиента, что вызывает сублимацию воды с поверхности. Затем создается реплика путем напыления углерода и платины на поверхность излома.

Исходный образец отделяют от реплики, которую затем переносят на сетку для просвечивающей электронной микроскопии. В конечном итоге метод замораживания-излома-травления используется для визуализации трехмерных структурных деталей клеточных мембран, молекулярных массивов и наноматериалов при исследовании с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Основное преимущество этого метода перед существующими способами, такими как исследование ультратонких срезов, заключается в том, что исследуемые объекты можно рассматривать в трех измерениях с разрешением электронной микроскопии.

Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области клеточной и молекулярной биологии, а также нанотехнологий, такие как определение размерных и структурных характеристик клеточных мембран и организация массивов молекул и наноматериалов. Идея этого метода возникла у меня, когда я заметил, что аналогичные исследования проводились на эукариотических протистах и привели к важным открытиям, однако соответствующим аспектам здоровья человека уделялось ограниченное внимание. Начните выполнение данной процедуры с подготовки биологических образцов для метода замораживания-излома и замораживания-репликации, как описано в текстовом протоколе.

С помощью пинцета с тонкими концами и/или игл шприца малого диаметра выберите золотые или медные подложки подходящего размера и формы для обрабатываемого образца. Поместите небольшие фрагменты образца на верхнюю поверхность металлической подложки. Для получения одиночных реплик удалите излишки жидкости с края подложки с помощью фильтровальной бумаги, чтобы довести содержимое образца до липкой, слегка клейкой консистенции.

Для создания двойных реплик используйте иглы шприца малого диаметра, чтобы сформировать из ткани возвышение на suporte. Переверните другой suporte, точно расположите его над первым и осторожно прижмите к поверхности образца, создавая структуру типа «сэндвич».

Не выжимайте образец из пространства между двумя заготовками. Затем наполните два изолированных сосуда Дьюара жидким азотом. В первом сосуде размещается металлический стержень с небольшим углублением, которое используется для сжижения небольшого объема пропана из имеющегося в продаже баллона.

Второй сосуд представляет собой разделительный контейнер для кратковременного хранения замороженных образцов в жидком азоте. Используйте пропан только в вытяжном шкафу, сертифицированном для таких целей. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать воздействия посторонних источников возгорания, используйте одежду, защищающую от низких температур, и обеспечьте надлежащую вентиляцию, так как пропан является взрывоопасным веществом.

При контакте может вызвать обморожение; является асфиксикантом. Поместив сопло баллона в колодец с пропаном, полностью откройте вентиль баллона и позвольте газу поступать в колодец первого сосуда, где он максимально быстро перейдет в жидкое состояние. Захватите предметное стекло с образцом с помощью прецизионного пинцета и погрузите его в сжиженный газ в первом сосуде на несколько секунд.

Затем быстро перенесите образцы во второй сосуд с жидким азотом. После замораживания образцов храните их в жидком азоте до момента переноса в установку для замораживания-скалывания. Поместите золотые подложки с образцами в держатель для двойных реплик книжного типа или в зажимное устройство в жидком азоте и поддерживайте их в этом состоянии до момента установки в камеру для образцов.

Когда в камере будет достигнут глубокий вакуум, а предметный столик будет охлажден до температуры жидкого азота, выключите насос, разгерметизируйте камеру и как можно быстрее установите смонтированные держатели образцов на предметный столик. Затем снова включите насос, восстановите глубокий вакуум и с помощью электронных регуляторов температуры столика и рычага установите температуру предметного столика на -100 °C. Также направьте поток жидкого азота на рычаг микротома, чтобы охладить его до температуры жидкого азота.

После достижения высокого вакуума, при температуре предметного столика -100 °C и температуре рычага микротома, соответствующей температуре жидкого азота, дистанционно откройте двойной держатель реплик образцов, тем самым вызывая излом образцов на монтажных подложках. В качестве дополнительного необязательного этапа образцы можно подвергнуть травлению для выявления скрытых структур после излома. Для проведения травления используйте лезвие бритвы, закрепленное в зажиме на рычаге микротома, чтобы срезать слой с поверхности образцов. Расположите охлажденный рычаг микротома над поверхностями излома на одну или несколько минут для сублимации воды с целью обнажения истинных поверхностей клеток, внеклеточного матрикса и/или молекулярных ансамблей.

Затем включите платиново-углеродную электронную или резистивную пушку и нанесите тонкий слой платины и углерода на поверхность излома под углом от 30 до 45 градусов путем испарения. Обычно это занимает примерно 15–20 секунд. Аналогичным образом включите углеродную электронную или резистивную пушку и нанесите тонкий слой углерода на поверхность образца с изломом строго сверху под углом 90 градусов для обеспечения поддержки реплики. Это также обычно занимает примерно 15–20 секунд по завершении процессов репликации, создания теней и стабилизации углерода.

Выключите вакуумный насос и камеру, затем извлеките держатель образцов из прибора. С помощью прецизионного пинцета извлеките каждый золотой пробник с образцом из зажима с двойными репликами и дайте им оттаять в течение нескольких секунд, после чего осторожно опустите пробник на поверхность воды в планшете для микрокапель. Переместите реплики с помощью тонкой проволочной петли или стандартной медной сетки для электронного микроскопа, удерживаемой прецизионным пинцетом, в другой планшет с 5% раствором дихромата натрия в 50% серной кислоте на период от одного до нескольких часов. Эта ванна растворяет биологический материал образца, отделяя его от реплики.

По завершении процесса переваривания перенесите реплику обратно на поверхность чистой воды, а затем извлеките ее на стандартную медную сетку для электронной микроскопии. Храните поддерживающие реплики сетки в коммерчески доступных контейнерах для сеток, где они будут оставаться стабильными в течение многих лет. При бережном обращении или ультраструктурном исследовании реплик замораживания-излома и травления просматривайте реплики в просвечивающем электронном микроскопе при ускоряющем напряжении, обычно от 50 до 80 киловольт.

Зафиксируйте соответствующие изображения на стандартной пленке для ПЭМ или с помощью цифровой камеры высокого разрешения, расположенной в клеточной мембране у основания каждого эукариота. Ресничка и жгутик представляют собой массив ассоциированных с мембраной частиц, организованных в нити ENC, которые окружают стержень реснички и известны как цилиарное ожерелье. Специализированные массивы мембранных частиц появляются на люминальной границе эпителиальных клеток, подвергающихся клиогенезу.

Данные массивы частиц представляют собой формирующиеся цилиарные ожерелья, расположенные у основания развивающихся и зрелых ресничек. Исследования различных эпителиев методом замораживания-скалывания выявляют сложную организацию анастомозирующих нитевидных и бороздчатых структур, окружающих апикальную часть базолатеральных границ. Скалывание мембран эпителиальных клеток обнаруживает поверхности плазматического разлома плотных контактов, которые выглядят как нити, в то время как внеклеточные поверхности разлома демонстрируют комплементарные им борозды.

Щелевые контакты обнаруживаются в препаратах замораживания-скалывания в различных тканях и представлены в виде плотных массивов частиц на поверхностях разлома плазматической мембраны и соответствующих им углублений на внешней поверхности разлома. Представленные здесь изображения являются примером быстрого замораживания с глубоким травлением и ротационным напылением. Эпителиальная клетка была расколота по цитоплазме; поверхность разлома плазматической мембраны отчетливо видна за стрелками.

Настоящая поверхность клетки, выявленная в результате последующего травления. После освоения данной методики цикл ее выполнения занимает примерно три часа и позволяет получить от одного до трех образцов при условии правильного соблюдения протокола. При выполнении этой процедуры важно помнить, что отдельные этапы тесно взаимозависимы, и ошибка на одном из них может привести к тому, что результат после проявления будет непригоден для изучения и оценки.

Этот метод открыл исследователям в области клеточной и молекулярной биологии возможность изучить, каким образом генетические мутации вызывают структурные аномалии в клетках, что приводит к развитию патологических состояний и заболеваний.