Разработка устройства 3D Графен электрода Dielectrophoretic

В данном протоколе описаны процедуры изготовления трехмерной ламинированной графеновой бумаги и электродного микроустройства, а также экспериментальные методы манипулирования полистирольными микросферами или биологическими клетками с помощью электрофореза в диэлектрике или DEP внутри устройства. В дальнейшем мы будем использовать термин диэлектрофорез как DEP. Изготовление устройств осуществляется путем попеременного наслоения 50 микрон графеновой бумаги и N минус один слоев чувствительной к давлению полимерной ленты толщиной 100 микрон, что позволяет получить электроды сигнала и заземления в равных пропорциях.

Слои сжимают, обрезают, после чего в структуре просверливают микролунку. Наконец, к двум концам устройства с помощью серебряного эпоксидного клея прикрепляют два медных вывода. Вторым этапом является приготовление среды для DEP с требуемой проводимостью.

Затем полистирольные микросферы суспендируют в данном растворе среды в определенном объемном соотношении. Третьим и заключительным этапом является заполнение устройства подготовленной суспензией микросфер, установка его на предметный столик микроскопа, подключение устройства к генератору функций и последующий запуск DEP. В завершение с помощью микроскопа регистрируют DEP-отклики и изучают свойства клеток или частиц путем дальнейшего анализа.

Графен представляет собой универсальный материал, используемый благодаря своей прочности, а также тепловым и электрическим свойствам. В данном протоколе недорогая графеновая бумага используется в качестве проводящего электродного слоя в трехмерном диэлектрофоретическом микроустройстве, способном дифференцировать частицы и клетки для таких целей, как определение группы крови или медицинская диагностика патологических клеток. Преимущества этого микроустройства с электродами из графеновой бумаги включают упрощение изготовления, более высокую пропускную способность образцов и геометрическую универсальность.

Трехмерное неоднородное электрическое поле позволяет манипулировать большими объемами образцов с помощью сил диэлектрофореза (ДЭФ), которые уникальны своей способностью различать поляризуемые частицы и клетки на основе их внутренних химических и морфологических свойств. Соберите ламинированное устройство, используя графеновую бумагу и клейкую ленту. В данной работе мы используем гидрофобную графеновую бумагу толщиной 75 мкм от коммерческого производителя и чувствительную к давлению двустороннюю клейкую ленту толщиной 100 мкм.

Сначала с помощью хирургического скальпеля и линейки вырежьте из графеновой бумаги прямоугольники размером 6,7 сантиметров на 1,5 сантиметра, а затем с помощью ножниц нарежьте двустороннюю клейкую ленту на пять полосок размером 1,3 сантиметра на приблизительно пять сантиметров. Положите первый слой графеновой бумаги на чистый предметное стекло. Медленно закройте один конец графеновой бумаги одной полоской ленты, оставляя отступ приблизительно два миллиметра, чтобы обеспечить изоляцию между любыми двумя соседними слоями графеновой бумаги.

Поместите второй слой графеновой бумаги поверх ленты. Сместите его относительно первого слоя графеновой бумаги. Приложите умеренное давление сверху, чтобы обеспечить хорошее прилегание слоев друг к другу.

Повторите два предыдущих шага для остальных слоев, убедившись, что верхний и нижний слои представляют собой графеную бумагу. С помощью ножниц удалите излишки ленты с краев устройства, оставив небольшой зазор примерно в один миллиметр, чтобы обеспечить герметичную изоляцию между слоями графеную бумаги. Проведите быструю проверку изоляции с помощью мультиметра, расположив положительный и отрицательный щупы на электрических выводах с противоположных сторон устройства.

Высокое сопротивление, составляющее примерно сотни килоом, указывает на хорошую изоляцию между слоями. Теперь ламинированная структура готова к микросверлению. Мы используем микрофрезерный станок для сверления микроотверстия в ламинированной структуре.

В данной работе мы используем микрофрезу диаметром 700 micron и длиной режущей части около 2.1 millimeter. Выбор микрофрезы обусловлен диаметром микролунки и толщиной устройства. Зафиксируйте ламинированную структуру на столе микросверлильного станка с помощью зажимов, с помощью компьютерного управления расположите кончик фрезы непосредственно над структурой и включите подачу сжатого воздуха на устройство. Запустите вращение фрезы, затем медленно опустите её в центр ламинированной структуры и проведите насквозь.

Остановитесь на глубине, немного превышающей глубину ламинированной структуры, чтобы обеспечить полное удаление мусора из нового отверстия. Несколько раз переместите концевую фрезу вверх и вниз по микроотверстию, чтобы разгладить его внутреннюю стенку.

Внутренняя поверхность микролунки должна быть максимально вертикальной и чистой. Для обеспечения оптимальных градиентов электрического поля и прохождения света через микролунку разрежьте стандартную медную проволоку калибра 32 на два отрезка длиной по 3 см и сделайте два прямых угла на расстоянии 2 см. Вручную смешайте примерно 0,75 мм компонента А и примерно 0,75 мм компонента B токопроводящего серебряного эпоксидного клея.

В небольшом контейнере закрепите провода, аккуратно нанося серебряный эпоксидный клей на концы и между всеми тремя слоями графеновой бумаги для обеспечения надежного контакта между слоями. Затем поместите провод длиной один сантиметр между любыми двумя слоями и слегка сожмите слои, чтобы удалить излишки эпоксидного клея и обеспечить хороший электрический контакт. Повторите процедуру с другой стороны ламинированной структуры.

Поместите устройство целиком на стойку и высушите в печи в течение ночи при 70 °C и одном атмосферном давлении. Извлеките устройство из печи и проверьте электрическую изоляцию между выводами электродов. Далее мы подготавливаем среды с различной электропроводностью, смешивая заранее приготовленный раствор mannitol с концентрацией 290 мОсм/л и PBS в разных пропорциях.

Данные растворы являются простыми аналогами, подобранными для грубой имитации буфера для культивирования клеток. Между объемным соотношением этих двух растворов и электропроводностью полученного раствора существует линейная корреляция; для смешивания полистирольных микросфер или биологических клеток с подготовленной проводящей средой в соотношении от 1:100 по объему с помощью пипетки перенесите 10 µL полистирольных микросфер и 1 mL раствора среды в пробирку для образца.

Тщательно перемешайте образец с помощью вортекса. Закрепите устройство на предметном стекле с умеренным усилием, используя модифицированные бумажные зажимы или их аналоги. Основание должно быть достаточно плотно прижато к микролунке, чтобы герметизировать ламинированную структуру относительно предметного стекла и предотвратить утечку образца.

Силу зажима следует контролировать, чтобы не деформировать устройство, что может негативно повлиять на геометрию лунки и путь прохождения света. С помощью стеклореза с алмазным наконечником вырежьте из покровного стекла толщиной 0,5 millimeter фрагмент, ширина которого будет чуть больше размера микролунки. Обрежьте покровное стекло до нужного размера и отложите в сторону. Используя данный микрошприц, медленно введите примерно 1 µL суспензии полистирольных бусин в микролунку. Чтобы избежать появления пузырьков, при их возникновении повторите инъекцию, стараясь не повредить острым уколом иглы стенки микролунки. Слегка переполните микролунку и немедленно накройте её подготовленным покровным стеклом, чтобы удалить излишки жидкости, предотвратить испарение и обеспечить воспроизводимость объемов.

Для каждого эксперимента надежно закрепите ламинированное микроустройство на предметном столике микроскопа и подключите генератор функций. С помощью зажимов «крокодил» соедините устройство с медными выводами и с помощью программного обеспечения микроскопа отрегулируйте фокус для четкого обзора микролунки. В центре экрана здесь: от 100 Hz до 10 MHz и 15 V.

На устройство подавали пиковые сигналы tope. Бусины наблюдали в микролунке при 10-кратном увеличении на расстоянии от 1 до 200 мкм над поверхностью предметного стекла. Нажмите кнопку, чтобы начать запись видео и сбор данных.

Запустите сигнал генератора функций через две секунды после начала записи видео. Изображения сохраняются в цифровом формате со скоростью от одного до пяти кадров в секунду в течение примерно пяти минут для последующего анализа интенсивности. По завершении эксперимента снимите устройство и разберите зажимы.

Очистите предметное стекло и устройство в мыльном растворе. Затем тщательно промойте их. В отсутствие электрического поля частицы осаждаются на дно устройства исключительно под действием силы тяжести. При воздействии электрического поля частотой около одного килогерца наблюдается положительный ДЭП-эффект, который проявляется в движении частиц вверх по градиенту поля по направлению к графенowej бумаге.

Электроды по краям микролунок наблюдаются при электрических полях с частотой выше 100 килогерц и в мегагерцовом диапазоне. Наблюдается отрицательный DEP, который проявляется в движении микросфер вниз по градиенту электрического поля к центру микролунки. Данное микроустройство с электродами из 3D-графеновой бумаги продемонстрировало экспериментальные результаты, которые тесно согласуются как с теоретически предсказанным поведением, так и с ранее опубликованными экспериментальными данными.

Изготовление устройств отличается исключительной универсальностью. Представленные протоколы могут быть легко адаптированы для создания устройств с бóльшим количеством слоев или из других материалов. В данном видео подробно описывается процесс серийного изготовления 3D-DEP микроустройства.

Тем не менее, в будущих приложениях суспензии частиц или клеток можно будет непрерывно пропускать через микролунку устройства для достижения более высокой пропускной способности. Примером универсальности DEP-сортировки является то, что водопоглощающая графеновая бумага может одновременно выполнять функции электрода и фильтра для концентраторов частиц или клеток или даже служить электрокинетическим биохимическим сенсором. После просмотра этого видео зрители должны получить четкое представление о том, как изготовить многослойное графеновое бумажное электродное микроустройство, а также о том, как эксплуатировать данное устройство для проведения экспериментов с частицами или клетками.