Протокол заразить Caenorhabditis Элеганс С Сальмонелла Typhimurium

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы заразить элеганс сальмонеллой для изучения взаимодействий патогенов хозяина. Это достигается путем подавления экспрессии гена хозяина с помощью РНК-интерференции. Вторым этапом процедуры является заражение РНК глазных червей сальмонеллой.

Инфекция останавливается путем переноса инфицированных червей на непатогенные РНК-пищевые пластины глаз. Заключительные шаги заключаются в регистрации выживаемости зараженных червей. Рассчитайте выживаемость на основе этих данных и, в конечном итоге, определите гены, необходимые для защиты от сальмонеллы.

Демонстрировать процедуру будет Джули Джон, техник из лаборатории. Начните с подготовки необходимых пластин для культивирования. Во-первых, сделайте агаровые пластины XLD.

Они избирательны в отношении сальмонелл, которые проявляются на этих пластинах в виде черных колоний. Обязательно ресуспендируйте агар XLD в воде из расчета один грамм на миллилитр, прежде чем смешивать его с полным объемом воды. Не автоклавировать.

Этот агар просто нагревается с помощью горячей плиты. Приступаем к изготовлению XLD пластин диаметром 95 миллиметров, добавляя по 25 миллилитров агара на тарелку. Чтобы подготовить подающие пластины NGM с помощью RNAI, чтобы сделать то, что называется RNAI-пластинами, используют стандартные методы, кратковременно добавляя ампициллин и химический индуктор РНКи, IPTG в среду после ее автоклавирования.

После охлаждения загрузите 60-миллиметровые пластины 12 миллилитров агара, пластины годны до месяца, хранятся при температуре четыре градуса Цельсия перед их использованием. Сначала они инкубируются с бактериями. В этом примере Beck one является целевым геном, поскольку он необходим для защиты от сальмонеллы.

Начните с создания РНКИ и контрольных культур. Добавьте хлопья замороженных бактерий из хранилища при температуре минус 80 градусов по Цельсию до двух миллилитров фунта с ампициллином. Бактерии должны либо экспрессировать РНК-интерференцию, либо нет, но при этом содержать пустой вектор.

Перенесите эти две культуры в инкубатор и вырастите их за ночь. Это следует делать еженедельно, чтобы бактерии всегда были доступны на следующий день. Засейте 100 микролитров культуры в РНК глазных пластин.

Сделайте не менее трех пластин каждого типа экспериментальными и контрольными в. Инкубируйте эти пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день доведите пластины до комнатной температуры.

Затем переложите на тарелки хорошо откормленных L четыре диких типа N двух гермафродитов. Трех червей на тарелку будет достаточно. Инкубируйте эти пластины при температуре 20 градусов Цельсия в тот же день.

Подготовьте больше пластин РНК-интерференции с культивируемыми бактериями. Через 36-40 часов при температуре 20 градусов Цельсия перенесите червей с первых пластин РНК-интерференции на новые пластины РНК-интерференции. Затем верните их к 20 градусам Цельсия еще на 64 часа.

Начните с высыпания бульона сальмонеллы из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов Цельсия на тарелку XLD. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день выберите изолированную черную колонию из тарелки и сделайте прививку двумя миллилитрами фунта.

На следующее утро поставьте его встряхивать на ночь при температуре 37 градусов Цельсия. Используйте инокулированный LB для посева шести пластин NGM. Нанесите по 80 микролитров на каждую пластину через шесть часов при комнатной температуре, бактериальная культура должна высохнуть и сформирует газон на пластинах NGM.

Затем перенесите одну РНК глаза, обработанных червями, и контрольные обработанные черви на шесть пластин. Загрузите по 40 червей на каждую тарелку и дайте им инкубироваться при температуре 20 градусов Цельсия в течение 48 часов. На этом этапе начните ежедневно готовить новые глазные пластины из РНК.

Это делается для того, чтобы они были готовы через два дня и каждый день после этого к анализу на выживание. Через 48 часов перенесите инфицированных червей обратно на свежеподготовленные пластины РНК-интерференции или на пустые контрольные пластины для векторов. После этого верните эти планшеты в инкубатор с температурой 20 градусов Цельсия каждый день во время их откладки.

Оцените выживаемость червей и перенесите выживших на свежие глазные пластины с РНК, чтобы оценить выживаемость. Прощупайте пляжного червя аккуратно с помощью сплющенной платиновой проволоки. Если реакции нет, червь мертв

Во время яйцекладки время. Один раз следует выявить червя, после чего умер от внутренней гигиены. Этих червей следует своевременно удалять.

Данные были бы значительно упорядочены, если бы этот белковый червь отчетливо считался экспериментальным червем. Как только червь перестанет откладывать яйца, необходимо только перекладывать их на свежие пластины RNAI два раза в неделю. После того, как популяции погибнут, объедините их данные и нарисуйте график их выживания на кривых Каплана-Мейера.

Каким бы ни был вывод, проведите эксперимент как минимум дважды, чтобы быть уверенным. При температуре 20 градусов по Цельсию средняя продолжительность жизни диких червей типа N два составляет 17 дней. Сальмонеллезная инфекция значительно снижает среднюю продолжительность жизни N-двух червей до 10,5 дней при ожидаемом лечении одной РНК-интерференцией Бека.

Снижение выживаемости после заражения сальмонеллой. Средняя продолжительность жизни снизилась с 10,5 до девяти дней, а максимальная продолжительность жизни также была значительно короче. Поддерживает роль Бека в защите морской элегантности от инфекции.

Животные получали одну РНК-интерференцию по методу Бека, но не получали сальмонеллу. Не имел заметных изменений в продолжительности жизни. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как освещать РНК-подход и протокол инфекции, чтобы изучить правило гена хозяина в защите от инфекции семины.