Цельноклеточная Записи патч-зажим от Morphologically- и нейрохимически выявленных гиппокампа Интернейроны

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы охарактеризовать эффекты, опосредованные рецептором ГАМК В, в идентифицированных интернейронах гиппокампа с положительным парвальбумином. Это достигается путем производства высококачественных острых срезов гиппокампа. Второй шаг заключается в использовании видеомикроскопа для отбора нейронов на основе венозной экспрессии YFP и известных характеристик паралальбуминпозитивных нейронов.

Затем получают записи клеточного зажима и используют либо внеклеточную стимуляцию, либо парные записи для изучения эффектов, опосредованных рецептором ГАМК В. Последним шагом является визуализация нейронов и подтверждение того, что записанные нейроны на самом деле являются паральбумин-положительными и являются либо парасоматическими, либо дендритными тормозными нейронами. В конечном счете, этот метод позволяет охарактеризовать ингибирующие эффекты, опосредованные рецептором ГАМК В, и позволяет однозначно классифицировать зарегистрированные интернейроны.

Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области межнейронов. Например, как межнейронные нейроны общаются друг с другом, как их возбудимость, их синаптический выход контролируется нейромодулирующими системами. Хотя этот метод дает представление о ГАМКергическом контроле гиппокампа в нейронах, он также может быть применен к другим областям мозга, нейромодулирующим системам или типам клеток.

Возьмите мозг трансгенной крысы в возрасте от 17 до 24 дней, экспрессирующей флуоресцентную венозную YFP, содержащуюся в полузамороженной карбогеновой сахарозе, СМЖ с помощью скальпеля, удалите лобную треть коры, мозжечок, и разделите полушария. Удалите дорсальную поверхность коры головного мозга, чтобы обеспечить ровную поверхность для склеивания мозга для разделения. Приклейте полусферы к viome stage с помощью viome bath, наполненной родной сахарозой розен карбоген.

Ликвор разрезает 300 микрометров поперечных срезов пласта гиппокампа. Переложите каждый ломтик в погружную камеру выдержки, содержащую карбоген сахарозу, спинномозговую жидкость при температуре 35 градусов Цельсия. Через 30 минут после помещения последнего ломтика в подогретую сахарозу, ликвор переложите ломтики при комнатной температуре для хранения.

Извлекайте патч-пипетки из стеклянных капилляров так, чтобы сопротивление пипетки составляло от двух до четырех мегаом. Когда он заполнится, перенесите срез гиппокампа в записывающую камеру, удерживая его на месте платиновым кольцом, нанизанным на одинарные волокна шелка. Поместите камеру в записывающую установку и начните перфузию с помощью карбогенного подогретого СМЖ со скоростью потока от пяти до 10 миллилитров в минуту.

Используйте видеокамеру для оценки качества среза под оптикой I-R-D-I-C при 40-кратном увеличении объектива. Предположим, что ломтик хорошего качества. Если на глубине от 20 до 30 мкм ниже гладкой и слегка кратерированной поверхности в слое можно увидеть большое количество круглых умеренно контрастных клеток одного параметалла.

Используя эпифлуоресцентное освещение, идентифицировать предполагаемые быстрые спайковые интернейроны как те, которые экспрессируют венозную YFP с большим мультиполярным соматическим слоем в параматическом слое или рядом с ним. Затем наполните патч-пипетки раствором, содержащим низкую и физиологически значимую концентрацию хлоридов для идентификации постсинаптических токов, и поместите его в держатель пипетки на головном столике. Затем подайте низкое положительное давление через трубку.

Опустите пипетку на поверхность среза, немного смещенную к центру выбранного нейрона. Увеличьте давление до 70-80 миллибар и быстро опустите пипетку через срез чуть выше сомы выбранной ячейки. Прижмите пипетку к клеточной мембране, чтобы на ней образовалась ямочка.

Выполните этот шаг быстро. Чтобы предотвратить мечение биотином соседних клеток, создайте гигаомное уплотнение, сбросив давление и одновременно подав на пипетку отрицательную команду напряжения 20 милливольт. Как только начнется герметизация, уменьшите команду напряжения до ожидаемого потенциала мембраны покоя, обычно в диапазоне от минус 70 до минус 60 милливольт.

Теперь подайте короткий импульс отрицательного давления, чтобы разорвать участок мембраны, тем самым достигнув конфигурации всей клетки. Используя режим зажима тока, определите быстро спайковые интернейроны по их реакции на семейство импульсов гиперполяризующего и деполяризующего тока. Чтобы наблюдать за синаптически вызванными реакциями, поместите электрод внеклеточной стимуляции в срез на границе молекулярного слоя радия и слоя laun oum.

В режиме зажима напряжения используйте изолированный стимулятор постоянного напряжения для подачи одиночных или 200 герцовых последовательностей пяти электрических стимулов напряжением 50 вольт на пресинаптические аксоны каждые 20 секунд. Далее нанесите в ванну антагонисты ионотропных глутаматных рецепторов для того, чтобы выявить выделенные моно. Синаптический IPSC.

Далее изолируют IPSC, опосредованный рецептором ГАМК В, с применением антагониста рецептора ГАМК. Чтобы начать сопряженную запись. Во-первых, установите полную клеточную запись пресинаптического интернейрона, как и раньше, и подтвердите фенотип быстрого спайка.

Затем прикрепите одну параметаллическую клетку CA на расстоянии от 20 до 100 микрометров от интернейрона, содержащего пресинаптический интернейрон. В режиме текущего зажима. Применяйте краткие импульсы деполяризующего тока порогового значения SRA для выявления потенциалов действия в интернейроне.

Если присутствует синаптическая связь, то потенциалы действия в интернейроне приводят к образованию ИПК в напряжении, зажатом примерно в одной параметаллической ячейке. Как только соединение установлено, выведите пары потенциалов действия в пресинаптическом быстроспайковом интернейроне с помощью типичного парного пульсового протокола из двух деполяризующих стимулов с интервалом в 50 миллисекунд. После сбора контрольных следов на перфузирующий ГАМК В рецептор баклофен наносят селективный агонист ГАМК В ликвор, активируя таким образом рецепторы ГАМК В.

Затем применяют антагонист CGP 55 8 45 для полного блокирования рецепторных эффектов. После завершения записи медленно извлеките пипетку из корпуса ячейки в вольт-клемве. По мере увеличения последовательно измеренного сопротивления уменьшите напряжение мембраны до отрицательных 40 милливольт, чтобы герметизировать соматическую мембрану путем формирования внешнего участка.

После записи зафиксируйте срезы, погрузив их в 4% параформальдегид с 0,1 молярного фосфатного буфера на ночь при четырех градусах Цельсия, затем в фосфатно-солевой буфер и заблокируйте 10% нормальной козьей сыворотки 0,03% TRITTON X 100 и 0,05% азида натрия на один час при комнатной температуре, чтобы пометить для экспрессии паральбумина. Используйте моноклональное мышиное антитело против парвальбумина, разведенное в растворе, содержащем 5% нормальной козьей сыворотки, 0,3% ТРИТТОН X 100 и 0,05% азида натрия в PBS, инкубируйте первичные антитела в течение двух-трех дней при четырех градусах Цельсия. После инкубации тщательно промойте срезы в PBS, нанесите флуоресцентные вторичные антитела против США вместе с биотинсвязывающим белком стриппином, конъюгированным с флуорохром, и инкубируйте в растворе, содержащем 3% нормальной козьей сыворотки, 0,1% триттона X 100 и 0,05% натрия, разведенного в PBS, инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день обильно промойте ломтики два-три раза PBS, а затем два-три полоскания в фосфатном буфере.

Закрепите срезы на предметных стеклах и используйте агаровую прокладку 300 микрометров, чтобы предотвратить схлопывание среза. Затем накройте срезы флуоресцентным монтажным средством и запечатайте лаком для ногтей. Оценивают паральбуминную иммунореактивность интернейрона с большим увеличением и числовой апертурой.

Клетки объективного хрусталика считаются иммуноактивными по отношению к паральбумину. Если видно, что иммунометка совпадает со структурами, меченными биотином, сделайте серию изображений по оси Z с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, визуализируя флуоресцентный Аден для морфологической идентификации и трехмерной реконструкции. Затем реконструируйте изображение в нейрон в трех измерениях, включая дендритную и аксональную арборизацию.

Здесь показана сложная синаптическая реакция быстро спайкового интернейрона в ответ на один внеклеточный стимул. Применение антагонистов ионотропных глутаматных рецепторов, изолятов DNQX и A PV, моносинаптического ингибирующего постсинаптического тока или применение IPSC антагониста рецептора ГАМК. Газин отменил быстрый компонент IPSC.

Последовательность из пяти стимулов выявила медленный IPSC, опосредованный рецептором ГАМК В, который был заблокирован последующим применением CGP. Эти следы показывают потенциалы действия в пресинаптических, быстро спайковых интернейронах и коротколатентных унитарных I ПСК в клетках одного параметалла КА в контрольных условиях после ванны, применения баклофена и последующего применения CGP. Следует отметить, что баклофен снижает амплитуду IPSC примерно на 50%, в то время как антагонист рецептора ГАМК B приводил к почти полному восстановлению амплитуды IPSC.

График временного хода амплитуды IPSC показывает эффект баклофена и CGPA: быстро спайковый интернейрон, показанный при 20-кратном увеличении, имел сомату, расположенную на границе слоя радия, и параматическую куклу примерно одной области с дендритами, идущими вертикально и охватывающими все слои. В то время как большая часть аксона находится в слое тела клетки и вокруг него, как это типично для корзинчатых клеток, изображение с 60-кратным увеличением показывает типичные корзины аксонов, образующихся вокруг предполагаемой параметаллической салаты, которые отмечены оранжевой звездочкой. Здесь показана трехмерная реконструкция того же интернейрона, в которой сома и дендриты выделены черным цветом, а аксон — красным.

Слои одного из них очерчены синим цветом после освоения. Эта методика может быть выполнена за один день с постдоковским морфологическим анализом, проводимым сразу на нескольких срезах после его разработки. Этот комбинированный подход проложил путь исследователям микросхем гиппокампа и коры головного мозга для изучения морфологического физиологического разнообразия, а также взаимосвязи структурных функций типов межнейронов.