Функциональный анализ для Gap Junctional экспертизы; Электропорация прилипшие клетки на индий-оксид олова

Электропорация — это метод, при котором на живые клетки воздействуют электрическим током для создания временных пор в клеточной мембране. Через эти поры в клетку могут проникать красители и другие молекулы, которые в обычных условиях не пересекают клеточную мембрану; поры быстро закрываются, не повреждая клетку. Мы опишем способ электропорации адгезивных клеток непосредственно в процессе их роста на предметном стекле, частично покрытом электропроводящим и прозрачным материалом.

Используемый материал — оксид индия-олова; поскольку он проводит электрический ток, он открывает поры, через которые краситель проникает в клетку. После этого можно определить, имеются ли в клетках щелевые контакты и в каком количестве; щелевые контакты представляют собой узкие каналы, которые соединяют внутренние пространства соседних клеток и обеспечивают прохождение малых молекул. Давно известно, что межклеточная коммуникация через щелевые контакты выполняет множество важных функций в клетке, включая неопластическую трансформацию и метастазирование.

Добро пожаловать в презентацию по клеточным проектам, посвященную проведению электропорации адгезивных клеток с использованием системы Insitu. На данном изображении показан результат нашей работы: флуоресцентный краситель LoXO Yellow был введен в клетки, растущие на прозрачном токопроводящем стекле. До этой линии, которая лучше видна при фазовом контрасте.

Вот результат. Видно, что краситель диффундировал через щелевые контакты из клеток слева, в которые краситель был введен методом электропорации, в клетки справа. Это привело к возникновению градиента флуоресценции; клетки трипсинизированы.

Затем их переносят в центрифужную пробирку. Очень важно, чтобы клетки были равномерно распределены по мере роста в камере. По этой причине рекомендуется центрифугировать клетки, чтобы удалить любые следы трипсина.

Среда с остатками трипсина удаляется с помощью вакуум-отсоса, клетки ресуспендируют примерно в одном миллилитре ростовой среды, после чего переносят в камеру. С помощью пипетки с клеточной суспензией, предварительно сняв крышку с камеры, капельно переносят клетки в камеру для облегчения манипуляций. Камеру помещают в чашку Петри диаметром шесть сантиметров.

Камеру возвращают в инкубатор для роста клеток. Рассеянные по подложке клетки будут равномерно распределяться, расти до соприкосновения друг с другом и формировать щелевые контакты. Когда клетки будут готовы к электрофорезу, установите на встроенном генераторе импульсов необходимые параметры.

Описание процесса простой настройки приведено в руководстве. При установке напряжения на установке insitu на клавиатуре загорится красный индикатор. Из водяной бани извлеките два подогретых флакона среды DMEM без кальция: один содержит DMEM без кальция с диализованной сывороткой, другой — просто DMEM.

При отсутствии кальция подготовьте дозаторы, набрав в пипеточный дозатор раствор желтого цвета. Извлеките клетки из инкубатора. Сначала удалите среду, перевернув емкость в стакан для промывки.

Затем аккуратно промокните образец салфеткой и промойте один раз DMEM без кальция; не пытайтесь удалить DMEM полностью, чтобы избежать высыхания клеток. Осторожно нанесите Lucifer yellow на барьер, чтобы не потревожить клетки, но сделайте это достаточно быстро, чтобы клетки не высохли. Используйте по 200 µL для каждой половины камеры.

Закройте крышкой камеру для исследования in situ, затем установите ее в слайдер. Убедитесь, что концевые выступы камеры вошли в пазы слайдера, нажав на слайдер. Вставьте камеру в держатель для камер.

Нажмите кнопку pulse на панели управления генератора импульсов. Светодиоды на генераторе импульсов и на держателе кюветы будут мигать красным во время процесса электропорации, а затем замигают зеленым, сигнализируя о завершении цикла инициализации. Отодвиньте ползунок обратно под держатель кюветы и извлеките кювету.

Отососите большую часть Lucifer yellow для последующего использования, стараясь не допустить высыхания клеток. Добавьте DMEM без кальция. При использовании диализованной сыворотки сыворотка способствует закрытию пор; после этого камеру возвращают в инкубатор для осуществления переноса Lucifer yellow через щелевые контакты.

Время выдержки должно быть одинаковым для каждого эксперимента. Стандартное время составляет три минуты. Слейте среду в стакан для отходов.

С помощью пастеризатора или пипетки добавьте 4% раствор формальдегида для фиксации. Выдержите при комнатной температуре не менее двух минут. Слейте формальдегид и промойте несколько раз PBS. Благодаря PBS клетки фиксируются на стекле, поэтому риск их отсоединения во время промывки минимален.

Для обеспечения возможности наблюдения за клетками в фазово-контрастном режиме важно поместить покровное стекло сверху на камеру. Заполните камеру PBS так, чтобы образовался выпуклый мениск. Осторожно наложите покровное стекло, избегая образования пузырьков воздуха.

Не беспокойтесь, если PBS перельется — просто промокните излишки PBS салфеткой. Вам понадобится инвертированный флуоресцентный микроскоп, желательно с фазовым контрастом и фильтром для Lucifer yellow. Используя фазовый контраст, найдите край области электропорации.

Под флуоресцентным микроскопом вы увидите две линии клеток. Половина предметного стекла будет интенсивно флуоресцировать. Линия, расположенная ближе всего к светящимся клеткам, представляет собой границу области электропорации.

Любая флуоресценция сверх этого уровня обусловлена переносом Lucifer yellow через щелевые контакты. Например, на данном изображении эпителиальных клеток видно, что клетки, подвергшиеся электропорации в левой части изображения, переносят Lucifer yellow в соседние неэлектропорированные клетки, создавая градиент светящихся клеток от края проводящего покрытия вправо. На этом изображении показан тот же участок клеток в фазово-контрастном режиме.

Обратите внимание, что линия X видна очень четко. Количественную оценку степени переноса через щелевые контакты можно провести вручную, используя изображения электропорированных клеток, полученные с помощью флуоресцентной и фазово-контрастной микроскопии. Клетки, отмеченные звездочками вдоль края проводящей области, считаются донорскими клетками.

В них была произведена электропорация, и они поглотили свободный желтый люциферазный маркер. Они передают желтую люциферазу соседним клеткам справа, которые, в свою очередь, передают ее дальше, при этом количество передаваемого маркера постепенно уменьшается.

Отношение количества точек к звездам, составляющее 41 к восьми в данном случае, позволяет рассчитать число для сравнения степени интенсивности переноса через щелевые контакты. Индекс щелевых контактов равен 5,1. В качестве альтернативы ручному маркированию и подсчету клеток можно использовать программное обеспечение для анализа изображений, чтобы измерить относительную интенсивность свечения вдоль неэлектрифицированной стороны границы электропорированной клетки.

Эти клетки не имеют щелевых контактов. Здесь виден правый край области электропорации. Обратите внимание, что градиент флуоресценции отсутствует, что указывает на отсутствие щелевых контактов при фазово-контрастной микроскопии.

Вы можете четко видеть все клетки. Обратите внимание, что линия X в данном примере также отчетливо видна.

Все клетки в камере стимулировали эпидермальным фактором роста EGF, а через 10 минут зафиксировали и провели зондирование на phospho arc. Обратите внимание, что окрашенные клетки справа не подвергались электропорации, а клетки слева до этой линии были электропорированы. В неэлектропорированных клетках наблюдается коричневое окрашивание при использовании антител к phospho irk и иммунопероксидазы.

Электропорированные клетки не окрашиваются, так как введенный методом электропорации фосфопептид заблокировал SSH2-домен белка Grb2 и ингибировал фосфорилирование ERK под действием EGF. Обратите внимание на область шириной в три-четыре клетки справа от линии, где клетки не подвергались электропорации, но также не окрашиваются. Это клетки, которые получили блокирующий пептид от соседних электропорированных клеток через щелевые контакты.

Это наиболее убедительное доказательство того, что ингибирование сигнала вызвано именно пептидом, а не является артефактом электропорации. Поскольку эти клетки не подвергались электропорации, на данном кадре представлено то же изображение, что и при фазово-контрастной микроскопии. Обратите внимание на отсутствие каких-либо изменений морфологии после электропорации.

В ряде случаев взаимодействие через щелевые контакты может быть точно количественно определено в широком спектре культур клеток. Введение пептидов для прерывания специфических сигнальных путей представляет собой эффективный подход к оценке значимости белков и белок-белковых взаимодействий в живых клетках, которые были идентифицированы с использованием очищенных белков. Это может стать первым важным шагом в разработке пептидомных препаратов.