РНК Catalyst в качестве корреспондента Скрининг препаратов против РНК редактирования в трипаносом

Общая цель этой процедуры заключается в анализе редактирования РНК с использованием функциональных омов, выделенных из Триаса Броче, для быстрой идентификации ингибиторов омов. Это достигается путем выделения митохондрий и целевых зон edito от tbr. Вторым этапом является подготовка субстрата для редактирования синтетической РНК.

Далее соединения подвергают связыванию с очищенными зонами редактирования вместе с репортером редактирования РНК. В присутствии соединений, блокирующих функцию зон редактирования, репортер РНК не будет подвергаться редактированию и останется неактивным. Последним шагом является добавление субстрата нити F и мониторинг способности репортера редактирования РНК избирательно и специфически расщеплять этот субстрат.

В случае ингибирующего соединения редактирование РНК блокируется, и будет обнаружен сниженный флуоресцентный сигнал или его отсутствие. В конечном счете, ПЦР-машина в реальном времени используется для мониторинга флуоресценции, излучаемой подложкой лада в зависимости от времени. Основное преимущество этого метода по сравнению с традиционными анализами редактирования in vitro заключается в том, что это простой и быстрый репортерный анализ на основе смешивания и измерения на основе флуоресцентного анализа, который может быть использован для высокопроизводительного скрининга химических соединений на фоне редактирования РНК.

Для начала приготовьте питательную среду для клеток ациклической формы tusi, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Далее выращиваем 300 миллилитров TBRC 1.7. Дикий тип про ациклическую форму клеток при температуре 28 градусов Цельсия, встряхивая их при 70 оборотах в минуту в течение 48 часов.

Как только ячейки достигнут плотности от 1,5 умножить на 10 до седьмой клетки на миллилитр, центрифугируйте ячейки при 6000 GS в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем промойте гранулу 50 миллилитрами охлажденного фосфата, буферным раствором, глюкозой или буфером PBSG и раскрутите клетки при 10 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Сначала мы суспендируем собранные клетки в 30 миллилитрах буфера DTE, разрушаем клеточную мембрану с помощью 40 миллилитров предварительно охлажденного стерильного пухового гомогенизатора 10 раз на льду.

Далее сразу по 4,3 миллилитров 60% сахарозы довести до гомогената и центрифуги. Раствор при 15, 800 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы обрушить митохондрии, повторно суспендируйте митохондриальную гранулу в 4,6 миллилитрах буфера STM.

Затем добавьте 13,8 микролитра 0,1 моляра хлорида кальция и четыре микролитра свободной РНК ДНК одного, и выдержите смесь в течение одного часа на льду. Затем инактивируйте ДНК, добавив 4,6 миллилитров STE-буфера, и центрифугируйте смесь при 15 800 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем повторно суспендируйте гранулу в 400 микролитрах буфера для лизиса и переложите смесь в микропробирку.

Добавьте 10% Triton X 100 в пробирку в конечной концентрации 1% и инкубируйте лизат при четырех градусах Цельсия на вращателе пробирки в течение 15 минут. Затем очистите лизат митохондрий, центрифугируя раствор два раза при 17 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, и каждый раз удерживайте очищенный раствор. Налейте 10 миллилитров, от 10% до 30% линейного градиента глицерина в ультрацентрифужную пробирку, используя два буфера для градиента XHHE, и маркер градиента, следуя инструкциям в руководстве.

Затем осторожно удалите 500 микролитров раствора с верхней части глицеринового градиента и аккуратно загрузите 500 микролитров очищенного митохондриального лизата в ультрацентрифужную пробирку. Вращайте трубку при давлении 178 000 GS в течение шести часов при четырех градусах Цельсия. Соберите 500 микролитровых фракций последовательно сверху вниз по градиенту под углом четыре градуса Цельсия.

Затем сфотографируйте, заморозьте фракции с помощью жидкого азота и храните их при температуре минус 80 градусов Цельсия. Анил соответствующую матрицу ДНК, содержащую комплементарную последовательность T seven в молярном соотношении один к одному. Затем расшифруйте РНК с помощью набора для транскрипции in vitro и следуйте инструкциям по эксплуатации.

Остановите реакцию транскрипции, добавив равный объем красителя из семи моляров мочевины. Запустите на фильтре стерилизованный 9%-ный денатурирующий полиакриламидный гель. Затем используйте коротковолновую ультрафиолетовую лампу для обнаружения и удаления соответствующей РНК.

Поместите вырезанный кусочек геля в микропробирку и добавьте 400 микролитров буфера для элюирования геля, разбавьте РНК в течение ночи при комнатной температуре на ротаторе пробирки. Затем осаждайте элюированную РНК, добавив один миллилитр холодного, 100% этанола и инкубируя при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 30 минут. Центрифугируйте смесь при 16 000 GS в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать РНК.

Затем промойте гранулу одним миллилитром 75%-ного этанола и центрифугируйте пробирку при 16 GS в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Затем мы суспендируем гранулу РНК в воде, свободной от РНК, для достижения желаемой концентрации в указанных пропорциях. Начните анализ с объединения одного микролитра pre A six RBZ и одного микролитра GA six RBZ в микропробирке.

Инкубируйте раствор при температуре 70 градусов Цельсия в течение трех минут и дайте ему настояться при комнатной температуре в течение 10 минут. Далее приготовьте мастер-микс и добавьте в микс anil pre A six RBZ и GA six RBZ. Последнее, затем дозируйте 18 микролитров мастер-смеси в лунки.

Затем запечатайте пластину с помощью герметика для пластин и поверните ее вниз, чтобы удалить пузырьки воздуха. Затем инкубируйте планшет при температуре 28 градусов Цельсия в течение четырех часов после инкубации при двух микролитрах GA шести RBZ конкурента. Для каждого хорошо поместите свежую пломбу на пластину, затем раскрутите ее вниз и выполните ПЦР в режиме реального времени с помощью следующей программы.

После завершения программы добавьте по одному микролитру подложки для ладов в каждую лунку до конечного объема 23 микролитра и запечатайте пластину свежим уплотнением. Быстро вращайте планшет и поместите его обратно в машину для ПЦР в режиме реального времени. Далее запрограммируйте новый эксперимент, состоящий из следующих шагов.

Затем настройте пластину, выбрав все лунки, которые требуют чтения, и выберите фильтр FAM. Установите входной объем 23 микролитра и начните прогон. Наконец, рассчитайте наклон значений, полученных из каждой выборки, чтобы получить кинетическое измерение, построив уклоны на гистограмме для анализа.

Для того чтобы определить качество данного анализа, было рассчитано отношение сигнал/шум различных подложек. Подложки для ладов с Tamara Quinter и Iowa Black dark Quinter являются жизнеспособными вариантами для использования в грохотах с высокой пропускной способностью. Фракции градиента глицерина были протестированы на активность редактирования in vitro с использованием флуоресцентного анализа, наиболее активные фракции могут быть объединены, когда требуется большая зона редактирования.

Для анализа переменных в реакциях анализа использовали различные контрольные образцы, в которых отсутствовали какие-либо компоненты редактирования РНК. При расщеплении субстрата наблюдалось в присутствии всех компонентов реакции редактирования в отсутствие ингибитора или в присутствии всех компонентов редактирования и неактивного соединения. Напротив, ингибирующее соединение может блокировать редактирование РНК и используется в качестве положительного контроля при попытке выполнения этой процедуры.

Важно поддерживать среду, свободную от РНК, и максимально защищать подложку ладов и светочувствительные соединения от света.