Усреднение вирусного гликопротеина оболочки Шипы от Electron Cryotomography реконструкциями с помощью Jsubtomo

Общая цель данной процедуры заключается в изучении структуры гликопротеиновых комплексов, расположенных на поверхности оболочечных вирусов. Для этого сначала определяют местоположение вирусных частиц в томографических объемах, ранее рассчитанных на основе данных электронной криомикроскопии. На втором этапе создают две статистически независимые начальные модели гликопротеиновых комплексов, используя вручную определенный поднабор данных.

Затем эти модели уточняются и используются для автоматического обнаружения всех гликопротеиновых комплексов на вирусных частицах. Заключительным этапом является уточнение структуры гликопротеинового комплекса с использованием полного набора данных. В конечном итоге для интерпретации итоговой структуры применяются инструменты молекулярной визуализации.

Трехмерный структурный анализ этих гликопротеиновых шипов неоценим для понимания патогенеза вируса, а также для разработки лекарственных препаратов. Основным преимуществом данного метода перед существующими, такими как рентгеновская кристаллография, является то, что он позволяет определять структуры мембранных белков в естественной мембранной среде. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов структурной биологии.

Например, структура многих вирусов, содержащих мембрану. Хотя этот метод позволяет получить представление о гликопротеиновых комплексах таких вирусов, его также можно применять к другим системам, таким как мембранные белки, встроенные в липосомы. Процедуру продемонстрируют два сотрудника моей группы, Slee и David Bittel.

Для начала откройте файл автограммы в программе B show. Вручную выберите вирусные частицы на граммах, определяя координаты центра каждой частицы с помощью инструмента для выбора частиц (particle picking tool). Повторяйте этот шаг до тех пор, пока не будут обработаны все варианты.

Сохраните координаты вирусов в star-файле. Повторите этот процесс для всех томограмм. Затем запустите J_sub_tomo.py в режиме экстракции. Чтобы извлечь варионные субтома в отдельные файлы томов, используйте сохраненные star-файлы в качестве входных данных для генерации двух независимых начальных моделей.

Сначала откройте файл карты субтомов яичника. В окне B выберите подмножество спайков в субтомах Varian, определив центральную координату спайка с помощью инструмента выбора частиц (particle picking tool), доступного в окне панели инструментов.

Повторяйте этот шаг до тех пор, пока не будут обработаны все четко различимые спайки. Сохраните координаты спайков в файле формата star. Повторяйте этот шаг, пока не будет обработано примерно 200 гликопротеиновых спайков.

После назначения проекций вариантам, как описано в текстовом протоколе, создайте маску в реальном пространстве с помощью J sub tomo. Запустите create mask py. Затем создайте маску в обратном пространстве с помощью J sub tomo create wedge mask py.

Маска обратного пространства используется для исключения областей в зоне «недостающего клина» (missing wedge), возникающей при сборе данных одноосевой томографии. Затем создайте два начальных усреднения с помощью J.Sub tomo create averages.PY, используя сохраненный файл выделения в качестве входного файла.

Для снижения уровня шума в исходных усредненных изображениях используйте итеративное выравнивание и усреднение двух ранее созданных моделей с помощью J sub tomo iterate gold PY. Подробную информацию о both стадиях этого процесса можно найти в текстовом протоколе. Оцените степень симметрии структуры, изучив полученный файл карты с низкочастотной фильтрацией в kyira. Например, если спайк представляет собой тримерный комплекс, должна быть очевидна трехкратная симметрия.

Продолжайте уточнение структуры, как подробно описано в текстовом протоколе. Затем сгенерируйте точки (seeds), равномерно расположенные на поверхности Varian, для сопоставления с шаблоном, и присвойте этим точкам начальный вектор обзора, запустив JVs py. Используйте ранее созданные star-файлы в качестве входных файлов; количество генерируемых точек должно быть примерно в 1,5 раза больше ожидаемого количества спайков.

Этот вектор обзора приблизительно соответствует направлению спайка, расположенного ближе всего к каждой начальной точке. Затем, как и прежде, создайте два независимых усредненных изображения поверхности вируса. После этого уточните положение начальных точек в соответствии с текстовым протоколом.

Наконец, сгенерируйте файлы маркеров com для уточненных файлов seed star с помощью jvs.py. Изучите семена, открыв файлы CMM и соответствующие файлы карт вирионов в Kyira.

Убедитесь, что уточненные семена (seeds) правильно ориентированы относительно мембраны вируса. Уточненные маркеры могут быть раскрашены на основе их коэффициентов кросс-корреляции. Автоматически определите положение всех спайков в суб-объемах варианта, используя локальный поиск по шаблону вокруг уточненных семян; выровняйте и усредните найденные спайки. В качестве начальных шаблонов используйте усредненные изображения, созданные из подмножества вручную отобранных спайков. Дополнительные сведения об этом процессе приведены в текстовом протоколе. Чтобы визуализировать результаты, откройте уточненную структуру спайка в программе Chimera.

Перейдите к подгонке атомных структур. Затем создайте композитную модель вириона с помощью j Subo Create model DO py. В завершение откройте композитную модель для визуализации в kyira.

Исходная модель была уточнена с использованием 205 вручную отобранных спайков. Трехкратная симметрия центрального спайка была очевидна без применения каких-либо операций симметрии и была наложена на последующие раунды уточнения для ручного обнаружения всех спайков на поверхностях Varian. Для каждого виона на радиусе 43 nanometers с шагом 20 degrees было сгенерировано 106 начальных позиций (seeds), положения которых итеративно уточнялись относительно мембраны.

Для расчета итогового среднего значения были использованы наиболее коррелирующие патчи гликопротеинового шипа. Среднее значение было определено с разрешением 35 ангстрем. Оно выявило тримерную структуру шипа в центре, а также определенный вклад шести соседних шипов.

Композитные модели вирионов, рассчитанные путем размещения структуры в известных позициях, выявили расположение спайков на поверхности вириона. В некоторых случаях наблюдались локально упорядоченные скопления спайков. При выполнении данной процедуры важно использовать только наиболее качественные данные и тщательно проверять все промежуточные результаты.

После выполнения этой процедуры структуры, полученные методом рентгеноструктурного анализа, можно совместить с итоговым усредненным modelos, чтобы получить более точное представление о белок-белковых взаимодействиях. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как выполнять усреднение структур вирусных белков-гликопротеинов оболочки с помощью J Omo.