ДНК-аффинно очищенного Чип (DAP-чип) Метод определения целей гена для бактериальных двухкомпонентный регуляторных систем

Общая цель следующего эксперимента заключается в определении сайтов геномного связывания бактериальных двухкомпонентных регуляторов ответа с помощью анализа на основе микрочипов in vitro. Это достигается путем клонирования и очистки меченого белка-регулятора ответа, его активации посредством фосфорилирования in vitro и определения одной генной мишени с помощью анализа сдвига электрофоретической подвижности, которая будет использоваться в качестве положительного контроля для последующих этапов анализа на микрочипах. На втором этапе очищенный белок-регулятор ответа смешивают с геномной ДНК, что позволяет отделить ДНК, связанную с белком, от исходной ДНК с помощью аффинной очистки.

Затем ДНК, связавшуюся с белком, и исходную ДНК амплифицируют; с помощью кПЦР подтверждают обогащение фракции белково-связанной ДНК мишенью гена положительного контроля, после чего образцы флуоресцентно метят, объединяют и гибридизируют с тайловым микрочипом. Для определения геномных сайтов связывания регулятора ответа результаты указывают на наиболее вероятные гены, регулируемые исследуемым регулятором ответа; полученные данные могут быть дополнительно подтверждены с помощью анализа сдвига электрофоретической подвижности. Основным преимуществом данного метода перед другими, такими как chip-chip in vivo, является возможность его применения даже в тех случаях, когда активирующие сигналы и условия для двухкомпонентных систем неизвестны.

Данный метод имеет большое значение для области изучения бактериальной сигнализации, так как для подавляющего большинства регуляторов ответа мишени-гены остаются неизвестными, и этот метод помогает распутать сложные регуляторные сети. Эту процедуру продемонстрирует Эми Чен, научный сотрудник моей лаборатории, перед началом выполнения данной процедуры.

Очистите rr, а именно белок DVU 3 0 2 3, экспрессированный из смеси клонированных генов DVU 3 0 2 3. Смешайте 0,5 picomoles белка DVU 3 0 2 3 со 100 fent moles предварительно подготовленного at inated ДНК-субстрата в буферном растворе до общего объема 20 µL. После подготовки контрольной реакции без белка инкубируйте смеси при комнатной температуре на лабораторном столе в течение 20 минут.

После инкубации добавьте 5 µL 5х буфера для нанесения в реакционные смеси для связывания. Нанесите по 18 µL каждой реакции на предварительно подготовленный мини-гель с 6% полиакриламидом в 0,5 XTBE и проводите электрофорез при 100 В в течение двух часов. После завершения электрофореза вырежьте заряженную нейлоновую мембрану по размеру геля и вымочите ее в 0,5 XTBE в течение не менее 10 минут. Затем извлеките гель из кассеты.

Обрежьте любые выступы на геле и поместите гель и мембрану между двумя толстыми листами фильтровальной бумаги, пропитанными 0,5 XTBE. Поместите гель и мембрану в аппарат для полусухого блоттинга и проведите электрофорез при 20 вольтах в течение 30 минут. После этого поместите мембрану в коммерческий прибор для УФ-сшивания, установив время воздействия на три минуты; после визуализации блота с помощью набора для хемилюминесцентной детекции получите изображение с помощью компьютера, подключенного к камере с ПЗС-матрицей.

Отметьте сдвиг подвижности ДНК-субстрата в присутствии rr, что указывает на связывание RR с тестируемой ДНК. Затем смешайте две-три микрограммы общей геномной ДНК с 0,5 пикомоль DVU 3 0 2 3 в буферном растворе. После инкубации реакционной смеси при 25 °C в течение 30 минут перенесите 10 µL в пробирку объемом 1,5 мл и пометьте ее как «исходная ДНК».

Добавьте 30 µL никелевой смолы NTA в микроцентрифужную пробирку объемом 0,6 мл. Центрифугируйте образец при 100 ×g в течение одной минуты, чтобы осадить смолу на дно пробирки. После центрифугирования удалите супернатант.

Добавьте 100 µL промывочного буфера и слегка встряхните пробирку, чтобы перемешать содержимое. После центрифугирования при 100 Gs в течение двух минут удалите супернатант. Добавьте оставшиеся 90 µL реакционной смеси для связывания к смоле Ni-NTA.

Затем инкубируйте образец в ротационном шейкере в течение 30 минут. По завершении центрифугируйте образец при 100 Gs в течение двух минут. После удаления супернатанта повторите этапы промывки еще три раза.

Затем добавьте 35 µL элюирующего буфера к смоле и перемешайте с помощью вортекса. Инкубируйте образец на лабораторном столе при комнатной температуре в течение пяти минут. После центрифугирования образца перенесите супернатант в новую пробирку объемом 1,5 мл и пометьте ее как фракцию ДНК, связанной с белком.

Затем добавьте 35 мкл элюирующего буфера к исходной ДНК после очистки фракций исходной и связанной с белком ДНК. Перенесите по 10 мкл каждой фракции в отдельные пробирки для ПЦР. Затем добавьте в каждый образец один мкл 10-кратного фрагментирующего буфера, два мкл буфера для подготовки библиотек и один мкл стабилизирующего раствора для библиотек, после чего тщательно перемешайте образцы на вортексе.

Инкубируйте образцы в термоциклере при 95 °C в течение двух минут. По завершении охладите образцы на льду. Затем добавьте в образцы 1 µL фермента для подготовки библиотек и перемешайте содержимое с помощью пипетирования.

Инкубируйте образцы в амплификаторе. После инкубации добавьте в каждую пробирку 47.5 µL воды, 7.5 µL 10x мастер-смеси для амплификации и 5 µL полимеразы. После перемешивания образцов нагрейте их в амплификаторе.

Подготовьте трипликатные реакции QPCR для каждого ДНК-матрицы, приготовив однократный (1x) мастер-микс для каждого ранее разработанного набора праймеров, затем внесите по 18 µL мастер-микса в каждую лунку 96-луночного PCR-планшета. Разбавьте амплифицированные и очищенные образцы входной и связанной с белком ДНК водой до концентрации 5 ng/µL и добавьте по 2 µL каждого образца в лунки. После этого запечатайте планшет с помощью sealing-пленки UltraClear QPCR.

Центрифугируйте планшет при 200 GS в течение одной минуты. После помещения планшета в прибор для ПЦР в реальном времени, используя следующие условия для маркировки входной ДНК с помощью s si three и обогащенной ДНК с помощью sci five, смешайте 1 µg ДНК с 40 µL S3 SCI-FI маркированных девятимеров и доведите объем до 80 µL водой. Денатурируйте образцы при 98 °C в течение 10 минут в темноте в термоциклере.

По завершении быстро охладите образцы на льду в течение двух минут, затем в каждую реакционную смесь добавьте по 2 µL 3'→5' экзонуклеазы-полимеразы, 5 mM дезоксинуклеотидтрифосфатов и 8 µL воды. После перемешивания инкубируйте смеси при 37 °C в течение двух часов в темном режиме в амплификаторе. Затем добавьте ЭДТА до концентрации 50 mM для остановки реакций и раствор хлорида натрия до концентрации 0,5 M.

Затем перенесите смесь в пробирки объемом 1,5 мл, содержащие 0,9 объема изопропанола, после инкубации в темноте в течение 10 минут. Центрифугируйте образцы при 12 000 g в течение 10 минут. Объедините по 6 µg ДНК с метками S3 и sci-fi в одной пробирке объемом 1,5 мл и высушите в вакуум-центрифуге при слабом нагреве в темноте, прикрыв крышку центрифуги, если она прозрачная.

После высыхания осадка суспендируйте его в 5 µL воды. Затем, после перемешивания на вортексе в течение 15 секунд, добавьте в образцы 13 µL предварительно приготовленного основного раствора для гибридизации (1x) и инкубируйте образцы в сухом термостате при 95 °C в течение пяти минут. Извлеките образцы из сухого термостата и поместите их в систему гибридизации при 42 °C до момента загрузки.

Затем поместите предварительно подготовленный узел смесительного предметного стекла в систему гибридизации. Внесите 16 µL образца в загрузочный порт. После этого закройте порты адгезивной пленкой и включите перемешивание в системе. Гибридизацию следует проводить в течение 16–20 часов при температуре 42 °C.

Поместите предметное стекло с миксером в инструмент для разборки и поместите его в чашку с теплым буфером. Снимите миксер, интенсивно встряхивая инструмент для разборки. Поместите предметное стекло в контейнер с 50 миллилитрами промывочного буфера 1 и интенсивно встряхивайте в течение двух минут.

Затем повторите предыдущий этап, используя 50 миллилитров промывочного буфера два и 50 миллилитров промывочного буфера три RRR DVU 3 0 2 3 shifted. Анализ QPCR апстрим-области DVU 3 0 2 5 показал, что эта область обогащена в белоксвязывающей фракции по сравнению с исходной ДНК, что свидетельствует о соответствии условий связывания для DVU 3 0 2 3; DVU 0 0 1 3 использовался в качестве отрицательного контроля. Четыре самых высоких пика, полученных после анализа DAP chipp, были выбраны как наиболее вероятные мишени для DV 3 0 2 3.

Положительная цель DVU 3 0 2 5 была первым полученным пиком с наивысшим баллом. Две другие генные цели представляют собой две другие кодирующие лактат-пермеазы. Четвертая генная цель находится не в апстрим-области, а в межгенной области между двумя конвергентно транскрибируемыми генами; для предсказания мотива сайта связывания с использованием апстрим-областей полученных целей применялся DAP chip meme.

Мотив был дополнительно подтвержден путем замены консервативных оснований внутри мотива, что привело к исчезновению сдвига связывания. Валидированный мотив использовался для сканирования геномов других сульфатредуцирующих бактерий, содержащих ортологи DVU 3 0 2 3; в качестве потенциальных генных мишеней выбирались локусы, в которых мотив располагался в областях выше открытых рамок считывания с использованием последовательностей мотивов, предсказанных для аутологичных rs. Был сгенерирован консенсусный мотив сайта связывания, который в значительной степени напоминал мотив для Divo Garris Hilton Burrow.

После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как использовать метод Daptive для определения генных мишеней регуляторных белков. Данный метод может быть применен для анализа масштабов связывания любого регуляторного белка при условии, что белок может быть очищен, а последовательность генома известна.